韓何丹 王海 高麗萍

[摘要]葡萄籽原花青素是由兒茶素和表兒茶素組成的低聚或高聚多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、清除自由基、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，因此，對于葡萄籽原花青素在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、調(diào)控信號分子等方面抗肺癌作用機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

[關(guān)鍵詞]葡萄籽原花青素；肺癌；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期

[中圖分類號]Q 946836[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]10050310（2018）01005005

Research Progress on Antilung Cancer Mechanism of

Grape Seed Proanthocyanidins

Han Hedan， Wang Hai， Gao Liping

（College of Biochemical Engineering， Beijing Union University， Beijing 100023，China）

Abstract： Grape seed proanthocyanidins is oligomeric or polymeric polyphenolic compounds， consisting of catechin and epicatechin with antioxidant， scavenging free radicals， antiinflammatory， antitumor and other biological activities. This paper summarized the research progress on antilung cancer mechanism of grape seed proanthocyanidins aboutproapoptotic effect， cell cycle arrest， progress in regulation of signaling molecules.

Keywords： Grape seed proanthocyanidins； Lung cancer； Apoptosis； Cell cycle

近年來，腫瘤的發(fā)病率逐年增高，尤其是肺癌，在惡性腫瘤中已居首位。盡管在過去的幾十年間，醫(yī)療取得了較大的進(jìn)步，但在我國，肺癌的5年存活率仍不足15%，在其他國家也是首位的癌癥致死原因。因此，人們迫切需要找到新的腫瘤治療手段。目前大約有2 000多種天然與合成的化學(xué)物質(zhì)在特定的臨床前研究中表現(xiàn)出化學(xué)預(yù)防和治療作用。原花青素是一大類可從植物中提取的、有多種生物活性功能的多酚化合物[1]。其中以葡萄籽中含量最高，葡萄籽中原花青素的提取量可達(dá)205%[23]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins， GSP）抗肺癌的效果良好。

1GSP簡介

11葡萄籽原花青素的成分和結(jié)構(gòu)

葡萄籽原花青素的成分主要是黃烷醇及其低聚物等黃酮類化合物，由以下4種基本結(jié)構(gòu)組成：（+）—兒茶素、（-）—表兒茶素、（-）—表兒茶素沒食子酸以及沒食子酸酯。GSP中這4種結(jié)構(gòu)的單體形式只占100%左右，此外，主要通過C4C6或C4C8連接形成二、三、四聚體的形式出現(xiàn)，最高聚合度為15。根據(jù)聚合度的不同，葡萄籽原花青素又分為高聚葡萄籽原花青素（polymeric grape seed proathocyanidins， PGSP）和低聚葡萄籽原花青素（oligomeric grape seed proathocyanidins， OGSP）。其中生物活性最強(qiáng)的是OGSP[46]。

12GSP的生物學(xué)活性

經(jīng)過大量的研究證實(shí)，GSP具有極強(qiáng)的清除自由基和抗氧化活性、抗疲勞、抗輻射損傷、延緩衰老、心血管保護(hù)作用及抗高血糖、抗腫瘤、抗誘變等作用[7]。它是目前公認(rèn)的抗氧化能力最強(qiáng)的天然抗氧化劑之一。在同等條件下，GSP的氧自由基清除能力是維生素C （VC）的5～6倍。通過建立生物膜模型檢測OGSP和維生素E （VE）的抗氧化能力時，發(fā)現(xiàn)原花青素較VE能有效延長羥基自由基誘導(dǎo)的卵磷脂脂質(zhì)體過氧化作用，而當(dāng)GSP和VE聯(lián)合使用時，發(fā)現(xiàn)二者具有明顯的協(xié)同作用，可以大大加強(qiáng)抗氧化作用。原花青素的清除自由基和抗氧化能力是目前被應(yīng)用得最多的方面，其作用主要表現(xiàn)在：1）有效地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基等，也可中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；2）參與磷脂、花生四烯酸的新陳代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，保護(hù)脂質(zhì)不發(fā)生過氧化損傷；3）為強(qiáng)有力的金屬螯合劑，可螯合金屬離子，在體內(nèi)形成惰性化合物；4）保護(hù)和穩(wěn)定維生素C（VC），并有助于VC的吸收。

13葡萄籽原花青素的生物利用度

從葡萄籽中提取的原花青素屬于生物類黃酮，其水溶性好，有效性高，其中低聚原花青素的生物利用度在90%以上，極易被人體吸收[6]。有研究通過給小鼠灌胃和大鼠腹腔注射14C標(biāo)記的原花青素，發(fā)現(xiàn)原花青素在胃腸道中吸收速度快，在45 min時達(dá)到吸收的最高峰，半衰期為5 h，有14%的原花青素在11 h內(nèi)經(jīng)過膽汁排出體外[8]。

北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)2018年1月

第32卷第1期韓何丹等：葡萄籽中原花青素抗肺癌作用機(jī)制研究進(jìn)展

14葡萄籽原花青素的安全性

毒理研究報(bào)道，給大鼠和小鼠口服葡萄籽原花青素，測得的半數(shù)致死劑量（LD50）均在4 000 mg/kg以上。Yamakoshi等研究報(bào)道多聚體葡萄籽原花青素在急性毒性劑量（2 g/kg、4 g/kg）和90天慢性毒性劑量（002%、02%、2%）下未見不良反應(yīng)，無可見有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level， NOAEL）為2%，相當(dāng)于男性1 410 mg/（kg·d），女性1 501 mg/（kg·d）[9]。微核實(shí)驗(yàn)[2 000 mg/（kg·d）]、Ames實(shí)驗(yàn)（5 000 μg/平板）結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素?zé)o致畸和致突變作用[10]。

2葡萄籽原花青素抗肺癌作用機(jī)制

21促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡。近年來學(xué)者提出，由外界刺激造成DNA損傷而誘發(fā)的細(xì)胞凋亡分子機(jī)制主要包括3條途徑，即線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑，且各途徑之間是緊密聯(lián)系和相互作用的[11]。細(xì)胞凋亡途徑在抗腫瘤藥物研究過程中發(fā)揮著重要的作用，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是大多數(shù)抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制之一。

張國瑜等以不同濃度的葡萄籽原花青素與人肺腺癌A549細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，結(jié)果表明原花青素在25～250 μg/mL范圍內(nèi)可呈時間和劑量依賴性地抑制A549細(xì)胞的增殖[12]。Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核破裂成碎片等細(xì)胞凋亡特征性變化。通過TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)0、25、25、250 μmol/L濃度原花青素組的細(xì)胞凋亡率分別為625%、1674%、1847%、2414%。另外，張國瑜等還發(fā)現(xiàn)25 mg/L和250 mg/L

質(zhì)量濃度的原花青素作用A549細(xì)胞24 h，瓊脂糖凝膠電泳可見凋亡細(xì)胞典型的梯狀DNA條帶，Caspase9、Caspase3蛋白表達(dá)量與花青素濃度成正相關(guān)，Bcl-2蛋白表達(dá)量與花青素濃度則成負(fù)相關(guān)，結(jié)果表明原花青素可通過線粒途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。

高愛霞等將人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH460在含不同濃度原花青素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，結(jié)果表明，花青素對細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，呈劑量—時間依賴性。DNA瓊脂糖凝膠電泳在50、100、200 μg/mL花青素組能檢測到明顯降解的梯形條帶，對照組和25 μg/mL組沒有凋亡條帶[14]。另外，高愛霞在Hoechst33258熒光染色實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)正常組和25 μg/mL花青素組細(xì)胞核為均勻藍(lán)色，50、100、200 μg/mL花青素組染色致密發(fā)亮且有部分細(xì)胞核斷裂成碎片的凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測25、50、100、200 μg/mL花青素對NCIH460細(xì)胞的凋亡率分別為13%、20%、117%和278%，明顯高于對照組[15]。

22阻滯肺癌細(xì)胞周期

細(xì)胞周期在細(xì)胞增殖與凋亡中起著重要的作用。細(xì)胞周期可分為G0/G1、S、G2/M三個階段，其中G1期與G2期進(jìn)行RNA的復(fù)制與有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，S期進(jìn)行DNA的復(fù)制，因此

，S期是完成遺傳信息復(fù)制的最重要的階段。阻滯細(xì)胞周期由G1期到S期的過渡是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的有效方法和治愈癌癥的重要前提條件。

參與細(xì)胞周期調(diào)控的因子有：細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase， CDK）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclindependent kinase inhibitor， CKI）、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白（Rb）。CKI為新發(fā)現(xiàn)的一類蛋白，通過與CDK、Cyclin或CyclinCDK復(fù)合物的結(jié)合，抑制CDK的激酶活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期正常有序地進(jìn)行。視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白Rb是一種抑癌基因表達(dá)的蛋白，可以通過調(diào)控細(xì)胞周期G1期的檢驗(yàn)點(diǎn)來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，Rb蛋白的活性由其磷酸化水平來調(diào)控。

根據(jù)王海等的研究報(bào)道，5 mg/L的順鉑（DDP）可以引起A549細(xì)胞S期阻滯，4 mg/L的OGSP能夠引起A549細(xì)胞G0/G1期阻滯，兩者聯(lián)用既能形成G0/G1期阻滯，又能形成S期阻滯。OGSP單獨(dú)處理可以顯著降低Cyclin D1和CDK4蛋白水平，并能夠顯著降低DDP引起的pRb蛋白水平的升高[16]。張小芳在GSP對肺腺癌SPCA-1細(xì)胞X射線放療的增敏作用的研究中發(fā)現(xiàn)，GSP對肺癌SPCA-1細(xì)胞有較好的放療增敏作用，增敏劑量在50～100 μg/mL之間，GSP能使G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期和G2/M期減少，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[17]。

23調(diào)控信號分子

231VEGF

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）又稱血管通透因子（vascular permeability factor， VPF），是胎兒和成人血管生成和血管生長過程中重要的調(diào)控因子。VEGF是特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的糖基化細(xì)胞有絲分裂素，在增強(qiáng)血管的滲透性、誘導(dǎo)血管生成和血管生長及內(nèi)皮細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用。癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移依賴新生血管的形成，VEGF是最有效的促血管生長因子。以VEGF及其受體VEGFR為靶點(diǎn)治療癌癥是藥物研究的熱點(diǎn)。

陳聶等在探討GSP對大鼠肺纖維化的治療作用的研究中發(fā)現(xiàn)，用博萊霉素誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化后，大鼠肺組織VEGF和VEGFR1蛋白及mRNA含量均明顯高于正常對照組，而GSP組中VEGF和VEGFR1蛋白及mRNA含量均明顯低于模型組，且給予GSP 7天和14天，VEGFR1和mRNA的表達(dá)依然低于模型組[18]。因此，GSP可有效抑制VEGF和VEGFR1的表達(dá)來抑制肺組織病理性血管生成，從而起到抗肺纖維化的作用。

232EGFR

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）是一種廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上的多功能糖蛋白，是原癌基因cerbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，EGFR 及其配體是細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分。研究表明，EGFR基因拷貝數(shù)增加或者過度表達(dá)，均能促進(jìn)正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。Castanon等和Sette等發(fā)現(xiàn)在健康人肺組織中EGFR呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)，而在超過60%以上肺癌患者中存在過表達(dá)[1920]。因此，EGFR的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的形成和發(fā)展過程中起重要作用。

EGFR的信號傳導(dǎo)關(guān)乎細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、遷移和細(xì)胞周期循環(huán)，與腫瘤的形成和惡化息息相關(guān)。周也涵等研究GSP對肺癌A549細(xì)胞的侵襲和遷移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSP以劑量依賴的方式抑制A549細(xì)胞的增殖，并顯著降低EGFR的蛋白表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞遷移和遷移能力明顯下降[21]。

233GST-π

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione stransferase，GST）是廣泛分布于各種生物體內(nèi)的一組多功能同工酶[22]，是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。其主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原性谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性，使其易于穿越細(xì)胞膜，并在被分解后排出體外，從而達(dá)到解毒的目的[2325]。依GST同工酶亞基結(jié)構(gòu)和等電點(diǎn)的不同，將GST分為α、θ、μ、π和σ五種[26]，π類谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GSTπ）的作用大于其他同工酶類，與人類腫瘤關(guān)系密切[2728]。近年來的實(shí)驗(yàn)研究表明，GSTπ在腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為出現(xiàn)之前就可表現(xiàn)出表達(dá)的異常升高，形成酶變灶或酶變細(xì)胞，參與腫瘤的遷延、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。涂靜以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NSCLC為研究對象，發(fā)現(xiàn)花青素可以減少NSCLC細(xì)胞GSTπ的mRNA含量和蛋白表達(dá)，可降低由GSTπ高表達(dá)帶來遷延轉(zhuǎn)移多藥耐藥等生物學(xué)行為，有助于肺癌的臨床化療[29]。

234COX2

環(huán)氧合酶（COX）是前列腺素（PGs）合成所必須的酶。目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中至少有兩種COX的編碼基因，即COX1和COX2兩種亞型。COX1和COX2具有61%的同源性，但卻表現(xiàn)出明顯的功能差異。COX2主要分布在細(xì)胞膜上，其表達(dá)調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，COX2與炎癥和腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。在生理狀態(tài)下，COX2在大多數(shù)組織中不表達(dá)或微表達(dá)，但在正常組織癌變以及癌細(xì)胞增殖過程中均會過量表達(dá)，故該基因的表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生和惡化有關(guān)[3031]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[32]，COX2的表達(dá)會增加前列腺素E2（PGE2）的合成，PGE2可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并刺激BcL2蛋白表達(dá)，而后者抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

盧婷婷和梁統(tǒng)以白介素1β（IL1β）誘導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞A549為模型，研究原花青素對環(huán)氧合酶2（COX2）啟動子活性的影響[33]。此試驗(yàn)中用含完整的和NFκB結(jié)合位點(diǎn)突變的COX2啟動子的熒光素酶表達(dá)載體pGL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組加原花青素（20 μg/mL）培養(yǎng)，對照組加01% DMSO。結(jié)果顯示，未加原花青素的含完整COX2啟動子的A549細(xì)胞 COX2啟動子活性經(jīng)IL1β誘導(dǎo)后活性明顯增高，而NFκB結(jié)合位點(diǎn)突變的COX2啟動子活性很低，且經(jīng)IL1β誘導(dǎo)后活性無明顯變化。20 μg/mL原花青素作用下IL1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的完整COX2活性較未經(jīng)原花青素組有顯著降低，即原花青素對COX2的啟動子活性有明顯的抑制作用。

3結(jié)束語

肺癌作為人類發(fā)病率最高的癌癥，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，人們不僅需要積極探索研發(fā)更有效的治療方法，也應(yīng)該重視對肺癌的預(yù)防和早期診斷，降低肺癌的發(fā)病率，有效地降低肺癌對人類的危害。國內(nèi)外大量的研究結(jié)果對葡萄籽原花青素的抗腫瘤作用都作出了肯定，且相對于現(xiàn)在常用的治療方式，葡萄籽原花青素對人體正常細(xì)胞并無毒副作用，這就為原花青素在肺癌的預(yù)防和治療中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。但是目前對原花青素的研究還僅局限于體外實(shí)驗(yàn)或動物實(shí)驗(yàn)，對其在人體上的抗肺癌作用還少見相關(guān)研究報(bào)道，所以對葡萄籽原花青素在人體的抗肺癌應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究。就目前關(guān)于葡萄籽原花青素的研究成果而言，它將是很有潛力的抗肺癌藥物。[參考文獻(xiàn)]

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（責(zé)任編輯李亞青）