王育選，王建明，呂藝瑤，李新鳳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）具有易變異、毒力變化快以及種下?；秃蜕硇》N較多的特點(diǎn)，給農(nóng)戶帶來(lái)防治困難[1]。因此，明確菌株間的本質(zhì)差異和群體遺傳結(jié)構(gòu)，不僅可實(shí)現(xiàn)該病害防治過(guò)程中對(duì)癥下藥，而且還可為選育抗病品種提供理論依據(jù)。分子標(biāo)記技術(shù)則從基因?qū)用鎸?duì)病原的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，可清晰地分析出不同尖鐮孢菌之間的進(jìn)化關(guān)系。

目前，應(yīng)用較為廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP[2-3]，RAPD[4-6]，rDNA-ITS[7-8]，ISSR[9]和 SSR[10]等，其中，SSR標(biāo)記優(yōu)勢(shì)明顯，該技術(shù)為共顯形，且在基因組中分散分布及具有豐富的多態(tài)性[11-12]，其已被應(yīng)用于番茄灰霉病菌[13]、大豆疫霉病菌[14-15]、蘋(píng)果黑星病菌[16-17]等病原真菌遺傳多樣性分析的研究中。張述義等[18]、李新鳳等[19]分別采用ISSR和EST-SSR對(duì)尖鐮孢菌進(jìn)行了遺傳多樣性研究，但有關(guān)利用Genomic-SSR標(biāo)記對(duì)尖鐮孢菌遺傳多樣性的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究利用全基因組SSR-PCR技術(shù)對(duì)山西省不同地區(qū)不同寄主的19株尖鐮孢菌與河北的2株尖鐮孢菌的寄主和地理來(lái)源與遺傳多樣性的關(guān)系進(jìn)行分析，旨在為明確山西地區(qū)尖鐮孢菌的進(jìn)化關(guān)系和遺傳多樣性提供理論依據(jù)，為山西地區(qū)該病害防治提供理論參考，為該類(lèi)病害抗病育種提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株及來(lái)源 21株尖鐮孢菌由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室單孢分離并保存，其詳細(xì)情況如表1所示。

1.1.2 供試引物 選取尖鐮孢菌全基因組中符合條件的SSR序列[20]，利用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，送由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 供試菌株及來(lái)源

1.2 試驗(yàn)儀器

C1000/C100 PCR基因擴(kuò)增儀（美國(guó)BIORAD公司），HT-SCZ04C型垂直電泳槽（北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司），冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），紫外/可見(jiàn)光/熒光分光光度計(jì)（美國(guó)BIORAD公司），移液器、分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌絲培養(yǎng) 用PDA培養(yǎng)基在25℃定溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)供試菌株3～5 d，之后在菌株邊緣取少量菌絲轉(zhuǎn)移到查彼液體培養(yǎng)基（硝酸鈉2 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，蔗糖 30 g）中培養(yǎng)，于 25℃，150～200 r/min培養(yǎng)2～3 d，過(guò)濾得到菌絲。

1.3.2 CTAB法提取DNA 參考LODHI等[21]的方法對(duì)尖鐮孢菌基因組DNA進(jìn)行提?。悍Q取50 mg菌絲于2 mL離心管內(nèi)，加液氮研磨；在離心管內(nèi)加500 μL提取液，60℃水浴60 min；在離心管內(nèi)加64 μL 的 10%（m/V）CTAB 和 140 μL 的 5 mol/L NaCl，65℃水浴10 min；將200 μL的氯仿異戊醇（24∶1）加入離心管，于4℃下離心10 min，轉(zhuǎn)速14 000 r/min，進(jìn)行基因組DNA的抽提，相同過(guò)程執(zhí)行3次；取上清液于另一1.5 mL無(wú)菌離心管中，加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇和1/10體積的3 mol/L NaAc（pH值為5.2），于-20℃下過(guò)夜，沉淀基因組DNA；4℃下14 000 r/min離心10 min，沉淀DNA，去掉上清液，然后用70%乙醇洗滌2次，在超凈工作臺(tái)上吹干；將風(fēng)干的DNA溶于50 μL TE（或ddH2O）中于-20℃保存。

1.3.3 基因組SSR引物篩選 本試驗(yàn)共合成60對(duì)SSR引物，自供試尖鐮孢菌中，隨機(jī)選取3株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中選取擴(kuò)增效果好、具有豐富多態(tài)性的引物，用于21株尖鐮孢菌的PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系：模板DNA（20ng）1 μL，Trans Taq HiFi DNA Polymerase（5 U/μL）0.2 μL，10×Easy Taq Buffer for PAGE（+Mg2+）2 μL，上下游引物（0.25 μmol/L）各 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，ddH2O 補(bǔ)足 20 μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，退火40 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4℃冰箱內(nèi)（退火溫度參照引物合成報(bào)告單）。

1.3.4 PCR產(chǎn)物PAGE電泳檢測(cè) 用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，180 V恒電壓下，電泳2 h。然后，參考BASSAM等[22]的方法，用現(xiàn)配的0.1%AgNO3溶液銀染10～15 min，去離子水沖洗3次后，置于顯影液中進(jìn)行顯影，直至條帶清晰，最后用照相機(jī)拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)記錄與分析

觀察電泳擴(kuò)增條帶，分別用1和0記錄同一遷移率位置上條帶的有和無(wú)，用NTSYS-pc Version 2.10s軟件計(jì)算供試菌株間的遺傳相似系數(shù)，并進(jìn)行遺傳相似性分析、聚類(lèi)分析（UPGAM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

供試60對(duì)SSR引物中，多態(tài)性明顯且擴(kuò)增效果好的引物共11對(duì)。

以21株供試尖鐮孢菌為模板，利用篩選出的11對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果列于表2。從表2可以看出，共擴(kuò)增出39條譜帶，多數(shù)條帶分布在300～500 bp（圖1），其中，多態(tài)性條帶為39條，多態(tài)性比例為100%。平均每個(gè)引物產(chǎn)生3.6條多態(tài)性條帶。

2.2 供試的尖鐮孢菌的相似性系數(shù)矩陣分析

試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），供試菌株之間的遺傳相似系數(shù)為0.43～0.94，平均為0.662。其中，相似系數(shù)最大、親緣關(guān)系最近的菌株有3對(duì)，分別為分離自祁縣綠豆2號(hào)和3號(hào)菌株、運(yùn)城棉花17號(hào)和19號(hào)菌株和河北保定蘭花20號(hào)和21號(hào)菌株；來(lái)自大同番茄的15號(hào)菌株與來(lái)自祁縣茄子的1號(hào)菌株以及分離自太谷的蠶豆4號(hào)菌株、蠶豆5號(hào)菌株、西葫蘆8號(hào)菌株之間的遺傳相似系數(shù)最小，說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表2 供試尖鐮孢菌SSR-PCR擴(kuò)增效果

另外，菌株間的遺傳差異與其寄主和地理來(lái)源之間的關(guān)系較為復(fù)雜，多數(shù)寄主和地理來(lái)源相同的菌株間的遺傳相似系數(shù)較不同寄主和地理來(lái)源的菌株間的大；而有的菌株剛好相反，如分離自棉花的17號(hào)、18號(hào)與19號(hào)菌株中，來(lái)自運(yùn)城17號(hào)和19號(hào)菌株間的遺傳相似系數(shù)（0.94）明顯高于其各自與太谷18號(hào)菌株的遺傳相似系數(shù)（0.89，0.89），分離自黃瓜的太谷10號(hào)和12號(hào)菌株間的相似系數(shù)（0.89）高于其分別與夏縣9號(hào)、太原11號(hào)菌株的遺傳相似系數(shù)（0.69，0.59）。同是分離自番茄的大同15號(hào)菌株和太谷14號(hào)間的遺傳相似系數(shù)（0.53）比其與長(zhǎng)治蘭花16號(hào)菌株間的遺傳相似系數(shù)（0.64）小。

表3 21株尖鐮孢菌SSR擴(kuò)增多態(tài)性相似性系數(shù)矩陣

2.3 21株尖鐮孢菌SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析結(jié)果表明（圖2），尖鐮孢菌菌株類(lèi)群間總體遺傳相似系數(shù)在0.56～0.95，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.56時(shí)，21株尖鐮孢菌可分成2個(gè)SSR類(lèi)群（SSR groups，SG）；當(dāng)相似系數(shù)為 0.70時(shí)，21株尖鐮孢菌可分成5個(gè)SSR亞類(lèi)群；當(dāng)相似系數(shù)為0.95時(shí)，21株尖鐮孢菌可完全分開(kāi)?？梢?jiàn)，尖鐮孢菌基因組DNA的SSR區(qū)域存在明顯的遺傳分化，初步說(shuō)明全基因組SSR標(biāo)記技術(shù)用于研究尖鐮孢菌遺傳分化是有效可行的。

同一地理來(lái)源不同寄主的菌株分散在不同的類(lèi)群或亞類(lèi)群（圖2），如分離自夏縣的黃瓜9號(hào)和西瓜13號(hào)菌株、祁縣的茄子1號(hào)和綠豆2號(hào)菌株、太谷的地豆6號(hào)和蠶豆5號(hào)菌株；有些寄主來(lái)源相同而地理來(lái)源不同的菌株聚于不同類(lèi)群，如分離自太谷縣番茄（14號(hào)）與大同番茄（15號(hào)）分別聚在了SG-1和SG-2中（圖2）。

另外，雖然分離自黃瓜的9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)和12號(hào)聚在了不同類(lèi)群，但來(lái)自夏縣黃瓜9號(hào)和太原黃瓜11號(hào)聚在一支上，太谷黃瓜10號(hào)和12號(hào)聚在了一起；分離自運(yùn)城棉花17號(hào)和19號(hào)菌株聚在一起，然后和太谷棉花18號(hào)聚在一起，分離自河北蘭花的20號(hào)和21號(hào)菌株優(yōu)先聚在一起，然后才和分離自長(zhǎng)治蘭花的16號(hào)菌株聚在一起。說(shuō)明分離自相同寄主的菌株，其遺傳相似性與地理來(lái)源存在一定的相關(guān)性。

3 討論

本試驗(yàn)從供試60對(duì)多態(tài)性引物中，篩選出11對(duì)多態(tài)引物，其中，最多的為五核苷酸重復(fù)序列，共有5對(duì)。而陳長(zhǎng)卿[23]對(duì)中國(guó)小麥條銹病菌進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，二堿基和三堿基重復(fù)的多態(tài)性比三堿基以上重復(fù)類(lèi)型的多態(tài)性高。這可能與試驗(yàn)材料不同以及尖鐮孢菌全基因組SSR位點(diǎn)中五核苷酸為主要重復(fù)類(lèi)型有關(guān)[20，24-26]。

聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，遺傳相似系數(shù)越大，供試菌株劃分的亞類(lèi)群越多，當(dāng)相似系數(shù)為0.95時(shí)，供試尖鐮孢菌菌株全部分開(kāi)。分離自番茄的2個(gè)菌株分在不同的類(lèi)群中，但分離自黃瓜的9號(hào)和11號(hào)菌株聚集在一個(gè)分支上，說(shuō)明并不是所有的相同寄主不同地理來(lái)源的菌株都不能聚到一起。分離自河北蘭花的20號(hào)和21號(hào)菌株比長(zhǎng)治蘭花16號(hào)菌株優(yōu)先聚在一起，說(shuō)明寄主相同的菌株之間的親緣關(guān)系與地理來(lái)源有關(guān)。可見(jiàn)，在寄主相同時(shí)，SSR類(lèi)群劃分與其地理位置具有一定關(guān)系。

相似系數(shù)矩陣分析表明，供試各個(gè)菌株之間的遺傳相似系數(shù)為0.43～0.94，平均為0.662。寄主和地區(qū)不同的菌株相似系數(shù)比寄主或地區(qū)相同的菌株相似系數(shù)大，有的則相反。表明有的菌株間的遺傳系數(shù)與寄主和來(lái)源沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)。而分離自黃瓜的4個(gè)菌株及分離自棉花的3個(gè)菌株優(yōu)先聚在一起的現(xiàn)象，又說(shuō)明寄主相同的菌株間的相似性與其地理來(lái)源有一定的關(guān)聯(lián)。寄主和地理來(lái)源都相同的菌株間也存在遺傳差異，表明供試的各菌株在全基因組SSR區(qū)域有一定的遺傳差異。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，供試菌株的遺傳多樣性與地理來(lái)源相關(guān)性較小，這與苑琳等[26]利用SSR標(biāo)記研究擬輪枝鐮孢的遺傳多樣性分析與地區(qū)分布沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián)的結(jié)果不同，這可能與本研究所用供試菌株數(shù)量和分布存在一定局限性有關(guān)。

本研究結(jié)果初步說(shuō)明基因組SSR標(biāo)記用于尖鐮孢菌遺傳多樣性分析是可行的，但在本研究結(jié)果中仍有個(gè)別菌株寄主和地理來(lái)源相同但沒(méi)能優(yōu)先聚在一起，可能是由于供試菌株數(shù)量有限有關(guān)，因此，在后續(xù)研究中還需在增加菌株數(shù)量的基礎(chǔ)上，利用全基因組SSR標(biāo)記對(duì)山西地區(qū)的尖鐮孢菌遺傳多樣性進(jìn)行進(jìn)一步研究。