呂磊，宋國田，劉永飛，劉燕霏，楊建德，通信作者，張大偉，通信作者

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L-色氨酸重組高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化

呂磊1，宋國田2，劉永飛2，劉燕霏1，楊建德1，通信作者，張大偉2，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2. 中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300380）

L-色氨酸（L-tryptophan，L-Trp）是一種限制性氨基酸，是人體和動物體生長發(fā)育等重要生理活動的必需氨基酸之一，也是合成許多活性物質(zhì)的關(guān)鍵氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料和食品等方面，具有十分重要的商業(yè)價(jià)值。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的L-色氨酸近些年來一直備受關(guān)注，主要是因?yàn)槠鋬r(jià)格低廉、純度高、易分離等特點(diǎn)，因此利用微生物生產(chǎn)L-色氨酸在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)上具有十分可觀的應(yīng)用前景。利用色氨酸高產(chǎn)基因，經(jīng)基因工程重組到大腸桿菌內(nèi)，篩選出色氨酸高產(chǎn)菌株。通過控制溶氧、碳源、pH值及殘?zhí)呛縼碛行岣週-色氨酸的產(chǎn)量。利用原始菌株探究發(fā)酵過程中發(fā)酵罐內(nèi)的殘?zhí)呛?，發(fā)現(xiàn)殘?zhí)呛靠刂圃?% 時(shí)，菌體生長最為良好，生長周期最長。將不同比例的糖蜜與葡萄糖混合，作為發(fā)酵時(shí)的碳源，結(jié)果顯示當(dāng)比例為3∶1時(shí)L-色氨酸產(chǎn)量最大；在發(fā)酵過程中控制pH條件，將產(chǎn)量提高到18.9 g/L；將溶氧條件控制在35%、40% 兩個范圍，結(jié)果顯示溶氧40% 時(shí)L-色氨酸的產(chǎn)量達(dá)到27 g/L；將補(bǔ)料碳源換為60% 的葡萄糖及70% 的小麥糖，結(jié)果顯示葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，L-色氨酸產(chǎn)量較高。

L-色氨酸；發(fā)酵；優(yōu)化；高產(chǎn)菌株

L-色氨酸是人體和動物生命活動八種必需氨基酸之一，對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起重要作用，被稱為第二必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等方面[1-2]。在食品工業(yè)上主要用作食品營養(yǎng)增補(bǔ)劑，國內(nèi)外多地都將L-色氨酸制成食品添加劑，當(dāng)機(jī)體攝入這些食品后會產(chǎn)生許多積極的影響，例如提高人體對植物蛋白質(zhì)的利用率，加速蛋白分解利用[3]等。L-色氨酸可參與體內(nèi)脂肪代謝、降低動物肝臟脂肪含量，從而達(dá)到提高禽畜瘦肉比的目的[4]。色氨酸在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用也十分廣泛，起著不可或缺的作用。色氨酸對治療失眠癥、抑郁癥、躁狂癥和止痛有顯著效果。臨床研究發(fā)現(xiàn)，L-色氨酸與鐵劑、維生素合用可增強(qiáng)治療運(yùn)動性貧血的療效，與組氨酸一起使用還可治療消化道潰瘍[5]。

目前，世界上L-色氨酸的市場年需求量在5萬t以上[6]，世界范圍內(nèi)生產(chǎn)和消耗嚴(yán)重不平衡，在眾多生產(chǎn)方法中發(fā)酵法是較為廉價(jià)合適的方法，然而在生產(chǎn)菌過程中存在很多復(fù)雜調(diào)控因子致使難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的狀況，所以開發(fā)出一種新的低成本的色氨酸高產(chǎn)菌，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)迫在眉睫。近年來，隨著重組DNA技術(shù)的不斷發(fā)展、成熟，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的研究突飛猛進(jìn)。這種技術(shù)主要克服了超遠(yuǎn)緣雜交育種的障礙，將所需的目的基因即將微生物具有的氨基酸生物合酶的基因連接于質(zhì)粒，再導(dǎo)入到大腸桿菌中，將其轉(zhuǎn)化成氨基酸生產(chǎn)菌，達(dá)到所需基因擴(kuò)增、酶量增加的目的，從而提高氨基酸轉(zhuǎn)化率。但技術(shù)要求非常高，實(shí)施困難很大，還有很多不確定因素，現(xiàn)今國外只有幾家公司大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸，其中三家日本公司是利用微生物法生產(chǎn)L-色氨酸，主要應(yīng)用于生產(chǎn)飼料添加劑方面。

本文利用葡萄糖、糖蜜及小麥糖，在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。通過多次直接發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，改變發(fā)酵時(shí)的碳源、溶氧、pH及殘?zhí)呛康闹笜?biāo)，來優(yōu)化發(fā)酵工藝，檢測分析L-色氨酸的產(chǎn)量，盡可能提高其產(chǎn)量，從而降低工業(yè)生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、溶液和試劑

1.1.1 發(fā)酵所用色氨酸工程菌為中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所開發(fā)的菌株XLLT-4。

60% 葡萄糖溶液：稱取660 g一水合葡萄糖，加蒸餾水定容至1 L，作為發(fā)酵時(shí)的補(bǔ)料碳源和糖蜜及70%小麥糖一起115 ℃ 滅菌30 min；

四環(huán)素（15 mg/mL）：稱取0.15 g四環(huán)素粉末，加無水乙醇定容至10 mL，過濾除菌，因?yàn)樵囼?yàn)菌株帶有四環(huán)素抗性，所以四環(huán)素主要作用是防止培養(yǎng)基中生長雜菌；

30%（/）磷酸：量取30 mL的磷酸溶液并加入70 mL的去離子水，主要用于發(fā)酵過程控制發(fā)酵液pH；

MgSO4·7H2O：稱取1 g MgSO4·7H2O固體用去離子水定容至2 mL，過濾除菌，作為大腸桿菌生長繁殖所必需的微量元素；

FeSO4·7H2O：稱取7.5 mg FeSO4·7H2O用去離子水定溶至500 μL，過濾除菌，作為大腸桿菌生長繁殖所必需的微量元素；

L-絲氨酸（L-ser）：稱取0.5 g L-ser粉末溶于10 mL去離子水中，121 ℃滅菌30 min，L-絲氨酸是合成L-色氨酸必備的前體物質(zhì)；

10% 異丙醇：量取10 mL的異丙醇，用去離子水定容至1 L，進(jìn)行各項(xiàng)測試時(shí)都需用10%異丙醇沖洗色譜柱。

1.1.2 試管LB培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，用于活化凍存菌株，37 ℃，220 r/min，14～16 h。

1.1.3 種子培養(yǎng)基（/L）：60%葡萄糖 20 g，酵母粉 15 g，檸檬酸鈉0.5 g，KH2PO41.5 g，F(xiàn)eSO4· 7H2O 15 mg，VB1100 mg，MgSO4·7H2O 1 g。

按發(fā)酵罐工作體積（1 L）10% 的接種量制備種子培養(yǎng)基，按比例稱取兩份，攪拌均勻，分裝入兩個500 mL搖瓶中，121 ℃滅菌20 min。

取出隔夜活化的LB試管培養(yǎng)基，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，14～16 h。

1.1.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)基（/L）：60%葡萄糖20 g，（NH4）2SO410 g，KH2PO45 g，MgSO45 g，酵母粉2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 15 mg，MnSO4·H2O 15 mg，CuSO4·5H2O 4 mg，CoCl2·6H2O 4 mg，ZnSO4·7H2O 4 mg，生物素 30 μg，L-絲氨酸 0.5 g和甜菜堿 1 g。

所用3 L發(fā)酵罐工作時(shí)裝液量為1 L，配制雙份，需要用1.8 L的蒸餾水溶解試劑，121 ℃ 滅菌20 min。

1.1.5 色譜工作液：根據(jù)液相色譜儀操作說明，配制A、B、C、D相，如下。

A相是稱取12.436 g磷酸二氫鈉（色譜純）定容至2 L去離子水中，并用氫氧化鈉準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH為7.8。

B相是將甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、去離子水按照體積比45∶45∶10在通風(fēng)櫥稱量混勻。

C相是水相，量取1 L去離子水。

D相是10%的異丙醇，100 mL異丙醇溶于900 mL去離子水中。

流動相藥品均需抽濾，再做超聲處理，以除去溶液配制時(shí)產(chǎn)生的氣泡，避免對液相色譜儀及色譜柱造成損壞。

配制標(biāo)品時(shí)，先配制L-色氨酸母液，濃度為10 g/L。稱取10 mg L-色氨酸溶于1 mL去離子水中。再利用母液分別配制濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的樣品。配制完成后用1 mL注射器和無水濾膜過濾，各取1 mL裝入樣品瓶中即可。

1.2 方法

本文利用實(shí)驗(yàn)室改造并篩選出的L-色氨酸高產(chǎn)菌，采用微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸。每批次做兩個試驗(yàn)，互為對照，利用3 L發(fā)酵罐發(fā)酵。在發(fā)酵開始前，保證除單一變量（溶氧、pH、殘?zhí)呛考疤荚矗┩獾乃袟l件基本一致，這樣不會影響結(jié)果分析。在發(fā)酵開始后，每隔2 h測一次600（細(xì)菌光密度），在600為60左右時(shí)，開始留樣，以便檢測L-色氨酸產(chǎn)量。試驗(yàn)?zāi)康氖菫閷?shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸，所以初次試驗(yàn)采用混合碳源作為發(fā)酵補(bǔ)料，但也應(yīng)保持葡萄糖與糖蜜的比例適中。首次試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[4]的方法，將發(fā)酵時(shí)的溶氧控制在30%。考慮到發(fā)酵時(shí)可能會有副產(chǎn)物乙酸產(chǎn)生，所以將pH初步設(shè)定在7.0；第二次試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5]的方法，將pH改為6.8，并設(shè)置了pH為6.6的對照試驗(yàn)組；由于本試驗(yàn)菌株與文獻(xiàn)中的菌株不同，在分析第二次試驗(yàn)結(jié)果后，將溶氧濃度改為40%，并設(shè)置了對照試驗(yàn)組溶氧濃度45%，產(chǎn)量明顯提高。最后利用60%的葡萄糖和70%的小麥糖做檢測試驗(yàn)，結(jié)果顯示葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，L-色氨酸的產(chǎn)量最高。

實(shí)驗(yàn)最后一步是使用HPLC法測定發(fā)酵液中色氨酸濃度，在一定濃度范圍（0.5～2.5 g/L）內(nèi)，色氨酸吸收峰峰面積與色氨酸濃度呈線性關(guān)系（圖1）。利用圖1公式可計(jì)算出每批次發(fā)酵的L-色氨酸的濃度。

圖1 HPLC法檢測色氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

色氨酸的轉(zhuǎn)化率大致分為兩個部分。當(dāng)用60%葡萄糖或70%小麥糖作為碳源時(shí)，色氨酸轉(zhuǎn)化率代表色氨酸總產(chǎn)量（g）/消耗糖液中的60%葡萄糖或小麥糖總量（g）×100%；當(dāng)用糖蜜作為碳源時(shí)，色氨酸轉(zhuǎn)化率代表色氨酸總產(chǎn)量（g）/底糖和補(bǔ)料消耗糖蜜與葡萄糖混糖總量（g）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例混合碳源對L-色氨酸發(fā)酵的影響

在進(jìn)行首次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時(shí)，將葡萄糖和糖蜜分別以1∶6和1∶3的比例混勻，作為補(bǔ)料碳源，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同比例混合碳源對L-色氨酸發(fā)酵的影響

注：差異顯著性＝0.06

根據(jù)圖2可知，不同比例混合碳源對發(fā)酵罐內(nèi)菌體量及L-色氨酸產(chǎn)量的影響有所差異，最明顯的是菌體量。在葡萄糖：糖蜜為1∶6的發(fā)酵罐中，菌體量600值為47.2，而改變二者比例為1∶3時(shí)，600提高了56.4%。菌體量提高后，相應(yīng)L-色氨酸產(chǎn)量也明顯提高。

2.2 pH值對L-色氨酸發(fā)酵的影響

因?yàn)榘l(fā)酵過程中，大腸桿菌會有些副產(chǎn)物，例如乙酸等，會使發(fā)酵液變酸，影響菌體生長代謝，所以在第一次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，改變第二次試驗(yàn)中發(fā)酵罐內(nèi)的pH值，分別為6.8、6.6，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同pH值對L-色氨酸發(fā)酵的影響

注：差異顯著性＝0.04

與第一次試驗(yàn)中pH為7.0互為對照，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH為6.6時(shí)，L-色氨酸的產(chǎn)量比pH為6.8時(shí)還略微偏低，但與pH為7.0時(shí)相差無幾。最直觀表現(xiàn)在發(fā)酵罐內(nèi)菌體量的差異，600值分別相差了4.8和2.4。在發(fā)酵中，菌體量是影響最后產(chǎn)量最為重要的因素之一，所以在下次發(fā)酵時(shí)改變pH為6.8。

2.3 溶氧對L-色氨酸發(fā)酵的影響

基于前兩次試驗(yàn)的最優(yōu)條件，本次改變發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧條件，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溶氧對L-色氨酸發(fā)酵的影響

注：差異顯著性＝0.01

結(jié)合圖2中溶氧含量＝30% 時(shí)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)＝40% 時(shí)L-色氨酸產(chǎn)量最高，達(dá)到 27 g/L，而溶氧條件的改變對菌體量的影響幾乎不大。在發(fā)酵的不同時(shí)間，大腸桿菌的菌體量及呼吸強(qiáng)度不同，發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧條件也不停變化，因此需調(diào)節(jié)通氣量及轉(zhuǎn)速來保持發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧濃度。由此可見，發(fā)酵時(shí)保持溶氧濃度的穩(wěn)定有利于L-色氨酸產(chǎn)量的提高。

2.4 綜合檢測試驗(yàn)

采用之前探索出的條件，再做一次驗(yàn)證試驗(yàn)，利用60%的葡萄糖和70%的小麥糖進(jìn)行一次發(fā)酵。結(jié)果如圖5所示。

圖5 純碳源對L-色氨酸發(fā)酵的影響

注：差異顯著性＝0.002

結(jié)果顯示，利用60%的葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，L-色氨酸的產(chǎn)量和菌體量均為最高，菌體量比混合碳源發(fā)酵時(shí)提高了35.2%，產(chǎn)量調(diào)高了135.7%，對應(yīng)的轉(zhuǎn)化率也提高了2.9%。利用70%的小麥糖發(fā)酵，雖然產(chǎn)量和菌體量也非常高，但還是60%的葡萄糖作用效果更為明顯。

3 討論

L-色氨酸的生產(chǎn)最早主要依靠化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解法。胡永紅等[7]敘述了蛋白質(zhì)水解法，由于色氨酸本身在蛋白質(zhì)及各種谷物原料中含量不是很高，提取時(shí)蛋白質(zhì)容易被破壞，所以此種水解蛋白質(zhì)的方法并不適用。劉紅利等[8]用苯肼與丙烯醛和乙酰氨基丙二酸二乙酯的加成產(chǎn)物進(jìn)行縮合反應(yīng)，生成苯腙化合物，然后在酸性條件下環(huán)化，再在堿性條件下脫羧，最后對其水解就可得到DL-色氨酸，雖然得到較高的總收率（43.9%），但有機(jī)物污染較大，對環(huán)境和健康帶來很大威脅，結(jié)構(gòu)不單一，且后續(xù)處理花費(fèi)較高。許前會等[9]以蘆竹堿和海因?yàn)樵?，?jīng)縮水、水解合成DL-氨基酸，收率達(dá)41.6%，但后續(xù)涉及到的碘甲烷等物質(zhì)對環(huán)境危害較大，同時(shí)也具有結(jié)構(gòu)不單一的不足。蓋利剛等[10]發(fā)明了一種酪氨酸、色氨酸的化學(xué)制備方法，先將含氨基聚合物、芳香醛和無機(jī)酸加入到醇水溶液中，回流，固液分離，得固體I；再將固體I和無水乙醚、氫化鋰鋁混合，攪拌，固液分離，得固體II；之后將固體II與無水乙醇和環(huán)己烷的混合溶液、有機(jī)堿及乙酰胺基丙二酸二乙酯混合，回流，固液分離，取液體，經(jīng)蒸餾制得固體III；最后將固體III與無機(jī)酸溶液混合，回流，冷卻，調(diào)pH，取沉淀；于甲酸水溶液中重結(jié)晶，同樣這種方法對環(huán)境危害也較大。

Cheng等[11]研究了不同補(bǔ)料策略對色氨酸產(chǎn)量的影響，包括指數(shù)期補(bǔ)料、偽指數(shù)期補(bǔ)料、按照溶氧補(bǔ)料、按照發(fā)酵液中葡萄糖的量補(bǔ)料，實(shí)驗(yàn)中控制最大比生長速率控制在0.25 h-1以下，通過這些控制使得乙酸濃度為0.9 g/L，最終色氨酸產(chǎn)量為38.8 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為19.9%，這是相對很高的轉(zhuǎn)化率。為了解決碳源流向、提高轉(zhuǎn)化率問題，Lim等[12]通過UTR工程實(shí)現(xiàn)了精確調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)水平，為以后探索發(fā)酵產(chǎn)物的最大產(chǎn)量和產(chǎn)率提供了一種簡單方法的理論支撐。

由多次發(fā)酵試驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)對比，可以得出結(jié)論，當(dāng)發(fā)酵溫度控制在37℃，溶氧條件控制在40%，pH穩(wěn)定在6.8，補(bǔ)充碳源時(shí)，發(fā)酵罐內(nèi)的殘?zhí)橇靠刂圃?%左右時(shí)開始補(bǔ)糖，此時(shí)發(fā)酵效果最好，產(chǎn)L-色氨酸的量最多，轉(zhuǎn)化率最高，最穩(wěn)定。需要注意的是，在整個發(fā)酵過程中，因?yàn)槊看伟l(fā)酵用的菌株生長狀況不同，可根據(jù)發(fā)酵罐內(nèi)菌體生長狀況適宜地調(diào)節(jié)溶氧條件，可有效提高產(chǎn)量。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Optimization of fermentation process for recombinant high yield strain of L-tryptophan

Lü Lei1, SONG Guo-tian2, LIU Yong-fei2, LIU Yan-fei1, YANG Jian-de1,Corresponding Author, ZHANG Da-wei2,Corresponding Author

（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Science, Tianjin 300380, China）

L-tryptophanine（L-Trp）is a kind of restricted amino acid, which is one of the essential amino acids for the growth and development of human body and animal. It is one of the key amino acids in the synthesis of many active substances and has been widely used in medicine. The production of L- tryptophan by microbial fermentation has attracted much attention in recent years, mainly because of its low price, high purity and easy separation. Therefore, the production of L-tryptophan by microorganism has a promising application prospect in large-scale industrial production. In this paper, the tryptophan high yield gene was recombined intoby genetic engineering. By controlling dissolved oxygen, pH value of carbon source and residual sugar content, the yield of L-tryptophan was effectively increased by direct fermentation. In this experiment, the original strain was used to explore the content of residual sugar in fermenting tank. It was found that when the residual sugar content was controlled at 1%, the growth of bacteria was the best and the growth cycle was the longest. When molasses were mixed with glucose as carbon source during fermentation, the results showed that the yield of L-tryptophan was the highest when the ratio was 3∶1; then when the pH was controlled during fermentation, the yield was increased to 18.9 g/L；the dissolved oxygen condition was controlled in the range of 35% and 40%. The results showed that the production of L-tryptophan reached 27 g/L at dissolved oxygen 40%; Finally, 60% glucose and 70% wheat sugar were replaced by carbon source. The results showed that the yield of L-tryptophan was higher when glucose was the sole carbon source.

L-tryptophan; fermentation; optimization; high yield strain

1008-5394（2018）03-0060-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.013

TQ922

A

2018-03-29

天津自然科學(xué)基金項(xiàng)目（16JCYBJC23500）

呂磊（1995-），男，本科在讀，研究方向：微生物發(fā)酵。E-mail：824951764qq.com。

楊建德（1969-）男，教授，博士，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：jiandeyang@126.com。

張大偉（1978-），男，研究員，博士，研究方向：微生物發(fā)酵。E-mail：zhang _dw@tib.cas.cn。