王金富 曾方林 戴潔
(揚州市第三人民醫(yī)院 江蘇 揚州 225000)
異煙肼(INH)對結(jié)核分枝桿菌(MTB)具有較強的殺菌作用,是治療結(jié)核病重要的一線藥物。近些年,INH的耐藥率逐漸上升,全國抽樣調(diào)查顯示我國INH耐藥率已達17.6%,屬高耐藥國家。
INH的耐藥主要是由于基因突變造成,主要跟下列基因改變有關(guān):過氧化氫一過氧化物酶基因katG、烯酸基載體蛋自還原酶基因inhA、NADH脫氫酶基因ndh、酮酸基酸基轉(zhuǎn)移蛋自酶基因kasA、烷基過氧化氫酶基因ah-pC等[1]。本研究利用基因芯片技術(shù)對揚州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變位點特征進行了分析,現(xiàn)報道如下。
收集我院2017年經(jīng)傳統(tǒng)固體培養(yǎng),并經(jīng)鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株共505例。
儀器:基因芯片檢測配套儀器由北京博奧生物有限公司提供。試劑:傳統(tǒng)培養(yǎng)和鑒定試劑由珠海貝索生物有限公司提供,基因芯片試劑由北京博奧生物有限公司提供。基因芯片檢測katG基因315(AGC→ACC、AGC→AAC)和inhA -15(C→T)3個突變位點。
1.3.1 痰液化處理 將痰標(biāo)本用4%的氫氧化鈉(NaOH)溶液液化,液化好的上清液用于接種固體培養(yǎng)基和核酸提取。
1.3.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)嚴格按《結(jié)核病實驗室檢測操作規(guī)程》的要求進行,采用PNB和TCH進行鑒定,并定期用H37RV進行質(zhì)控。
1.3.3 核酸提取 煮沸法提取核酸。
1.3.4 基因芯片 核酸進行PCR擴增,產(chǎn)物用雜交緩沖液處理后在芯片雜交儀上進行雜交,再用芯片洗干儀進行洗滌和甩干,最后用芯片判別系統(tǒng)進行掃描和結(jié)果判讀,并詳細記錄判讀結(jié)果和芯片信息。
共檢出105例菌株發(fā)生耐藥基因突變,突變率為20.8%(105/505),katG基因單一突變?yōu)?1例,inhA基因單一突變?yōu)?2例,katG基因和inhA基因同時突變?yōu)?例。
katG 315(AGC→ACC)單一突變70例,katG 315(AGC→AAC)單一突變11例,inhA -15(C→T)單一突變?yōu)?2例,katG 315(AGC→ACC)聯(lián)合inhA -15(C→T)突變1例,katG 315(AGC→AAC)聯(lián)合inhA -15(C→T)突變1例。
表 耐INH MTB katG 和inhA 基因突變譜及突變頻率
MTB耐藥性的增加,導(dǎo)致耐藥結(jié)核病感染率逐年上升,加大了結(jié)核病防治的難度。許多研究表明,MTB耐藥主要是由于相關(guān)耐藥基因突變導(dǎo)致的,通過檢測相關(guān)耐藥基因是否發(fā)生突變,從而可推斷該MTB是否發(fā)生耐藥?;蛐酒夹g(shù)是近些年比較流行的一種基因檢測的分子技術(shù),其通過PCR技術(shù)對待測菌的基因片段進行擴增,將擴增片段與芯片雜交,即可得到基因突變位點和突變類型。該法具有快速、高通量、靈敏等特點,近來在MTB耐藥檢測中應(yīng)用廣泛,我們前期的研究[2]也驗證了基因芯片在MTB異煙肼耐藥檢測中具有較好的應(yīng)用效能。
研究表明,MTB對異煙肼耐藥主要是由katG、inhA、ndh、kasA、ah-pC五種基因引起,以katG、inhA突變較為常見,超過80%的耐藥由這兩個基因突變引起[3]。博奧基因芯片基于上述研究,只檢測五種基因中的katG、inhA,可檢出大部分耐INH的MTB。多數(shù)研究數(shù)據(jù)表明不同地區(qū)的臨床分離MTB異煙肼耐藥基因突變頻率存在差異[4]。katG基因編碼過氧化氫一過氧化物酶,其可使INH活化為異煙酸,使MTB不能合成胞壁枝菌酸,破壞MTB的保護屏障[5]。katG基因突變后導(dǎo)致INH無法活化為異煙酸,從而導(dǎo)致MTB對INH耐藥。InhA基因編碼的烯酸基還原酶是INH作用靶點,活化的INH能與InhA酶相結(jié)合,阻礙分枝菌酸合成,干擾長鏈脂肪酸的縮合。InhA基因的點突變和缺失造成inhA高度表達,至所需INH濃度增高導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生[6]。505例菌株共檢出105例基因發(fā)生突變,以katG突變?yōu)橹饕蛔冾愋?,突變頻率達79%(83/105)。與國內(nèi)其他地區(qū)的報道相近[7,8],但與西班牙的34.6%、俄羅斯的93.6%、香港的51%[9]存在一定的差距,這也證明了MTB耐藥基因的突變存在明顯的地區(qū)差異。本研究中,katG 315(AGC→ACC)為最常見突變,突變頻率為67.6%(71/105),與2015年的突變頻率69.2%相近,可以認為katG 315位點(AGC→ACC)突變?yōu)楸镜貐^(qū)最常見突變。24例檢測到InhA基因突變,突變頻率為22.5%,與吳雪瓊[10]和歐維正等人的結(jié)果相近,與朱中元[11]的結(jié)果差異較大,但需要注意的是,InhA基因突變往往只引起低水平耐藥。
本研究中,發(fā)現(xiàn)兩例菌株發(fā)生katG 315和inhA -15聯(lián)合突變,聯(lián)合突變往往被認為會導(dǎo)致高水耐藥。有兩例未能檢測到katG基因315位點,存在katG基因缺失,過去的研究認為基因缺失也會導(dǎo)致耐藥,但需要更多的研究來驗證。
綜上所述,本地區(qū)MTB對異煙肼耐藥基因突變中katG 315(AGC→ACC)為最主要突變,inhA -15(C→T)次之。