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        過(guò)氧化氫對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響

        2018-10-20 02:20:42史河秀劉玥許頌華王世鄂通訊作者
        醫(yī)藥前沿 2018年30期
        關(guān)鍵詞:小鼠實(shí)驗(yàn)研究

        史河秀 劉玥 許頌華 王世鄂(通訊作者)

        (1福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)部 福建 福州 350101)

        (2福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系 福建 福州 350004)

        活性氧自由基(ROS),包括超氧陰離子自由基(O2·-)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥基自由基(·OH)等。在各種哺乳動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中各種代謝和培養(yǎng)環(huán)境中都有可能產(chǎn)生過(guò)量ROS,導(dǎo)致氧化應(yīng)激現(xiàn)象發(fā)生,可嚴(yán)重影響早期胚胎的發(fā)育[1]。我們選擇最常研究的1-細(xì)胞胚和8-細(xì)胞胚為研究對(duì)象,以H2O2誘導(dǎo)小鼠體外培養(yǎng)的早期胚胎的氧化損傷,探討哪個(gè)階段的早期胚胎對(duì)氧化損傷更為敏感,為后續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)體系、提高囊胚獲取率提供理論基礎(chǔ)。

        1.材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        昆明(KM)小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(雌鼠4~6w,雄鼠8w以上),繼續(xù)飼養(yǎng)3~5d,調(diào)節(jié)生理周期,使其適應(yīng)環(huán)境供實(shí)驗(yàn)處理。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        KM雌鼠腹腔注射10IU PMSG,48h后注射10IU hCG,隨后與KM雄鼠1:1合籠,次日清晨檢查陰栓判斷是否受精。分別于hCG注射后27h,從有陰栓雌鼠輸卵管中收集1-細(xì)胞胚;于hCG注射后66h,從有陰栓雌鼠輸卵管和子宮中收集8-細(xì)胞胚。經(jīng)M2洗滌,KSOM培養(yǎng)液漂洗3次,挑取形態(tài)完好的1-細(xì)胞胚和8-細(xì)胞胚移至KSOM和H2O2處理微滴中,置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min,而后將早期胚胎細(xì)胞從微滴中移出,KSOM培養(yǎng)液分別洗滌3次,再移入預(yù)平衡好的KSOM培養(yǎng)微滴中繼續(xù)培養(yǎng),于hCG后42h、66h(體外培養(yǎng)相對(duì)較體內(nèi)發(fā)育速度慢,hCG后66h體外培養(yǎng)的多數(shù)處于4-細(xì)胞期,體內(nèi)發(fā)育的多數(shù)為8-細(xì)胞期)、96h和120h觀察和記錄早期胚胎發(fā)育情況,每組重復(fù)3次以上。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        表1 H2O2對(duì)KM小鼠1-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響

        表2 H2O2對(duì)KM小鼠8-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響

        KM小鼠1-細(xì)胞胚和8-細(xì)胞胚經(jīng)不同濃度的H2O2(1-細(xì)胞胚處理濃度為20、30、40和60μM;8-細(xì)胞胚處理濃度為0、30、60、100和200μM)處理,與對(duì)照組相比,1-細(xì)胞胚處理組結(jié)果:20μM處理組,發(fā)育到2-8細(xì)胞階段的發(fā)育率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但囊胚發(fā)育率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他組各階段發(fā)育率均有顯著差別,60μM處理組則發(fā)育完全阻滯;8-細(xì)胞胚處理組結(jié)果:30μM處理組其囊胚發(fā)育率差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,60μM處理組囊胚發(fā)育率仍有68.52%,200μM處理組發(fā)育完全阻滯。

        3.討論

        少量ROS在配子成熟、受精和胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。但是,ROS的過(guò)量產(chǎn)生,這可能誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化,核DNA斷裂和線粒體改變等,從而影響植入前胚的發(fā)育。例如,Liu等研究顯示ROS蓄積使線粒體活性和結(jié)構(gòu)改變而誘發(fā)胚胎發(fā)育阻滯[2]。在小鼠1-細(xì)胞胚中加入H2O2可誘導(dǎo)建立胚胎氧化損傷模型。本研究結(jié)果顯示:在1-細(xì)胞胚中加入20μM H2O2可引起囊胚發(fā)育率下降,60μM導(dǎo)致發(fā)育完全阻滯,也驗(yàn)證了H2O2可誘導(dǎo)建立胚胎氧化損傷模型。

        在8-細(xì)胞胚中,30μM處理組其囊胚發(fā)育率差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,60μM處理組囊胚發(fā)育率仍有68.52%,對(duì)桑椹胚的形成則幾乎沒(méi)有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:體外培養(yǎng)小鼠早期胚胎對(duì)H2O2造成的氧化應(yīng)激在1-細(xì)胞期比8-細(xì)胞期更為敏感。小鼠體外發(fā)育阻滯與小鼠合子型基因組激活緊密相關(guān),1-2細(xì)胞胚正處于合子基因組激活時(shí)期,因而體外培養(yǎng)1-細(xì)胞胚只需較低濃度的H2O2即可引起細(xì)胞發(fā)育阻滯,而8-細(xì)胞胚時(shí)期,已完成母型-合子型過(guò)渡,這段時(shí)間內(nèi)敏感性下降,因此需較高濃度的H2O2才會(huì)引起細(xì)胞發(fā)育阻滯。另外,有研究顯示多種抗氧化酶基因表達(dá)水平在小鼠胚胎2-細(xì)胞期均較低[3],而在體外培養(yǎng)的小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的ROS在2-細(xì)胞期時(shí)卻大幅度升高[4],體外培養(yǎng)的1-2細(xì)胞胚承受較高的ROS而自身的清除能力卻不足,所以本研究增加少量H2O2即可誘發(fā)發(fā)育阻滯。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著H2O2濃度的提高,發(fā)育阻滯主要發(fā)生于1-細(xì)胞到2-細(xì)胞的過(guò)渡,以及2-細(xì)胞到4-細(xì)胞的過(guò)渡,進(jìn)一步證實(shí)小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯可能與氧化損傷有關(guān)。因此,為了提高獲取率,我們可以對(duì)氧化損傷敏感的1-細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚為研究對(duì)象,進(jìn)一步研究如何減少小鼠體外培養(yǎng)早期胚胎的氧化損傷以及如何抵抗氧化損傷,提高體外培養(yǎng)的囊胚獲取率。

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