史河秀 劉玥 許頌華 王世鄂（通訊作者）

（1福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)部 福建 福州 350101）

（2福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系 福建 福州 350004）

活性氧自由基（ROS），包括超氧陰離子自由基（O2·-）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基自由基（·OH）等。在各種哺乳動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育過(guò)程中各種代謝和培養(yǎng)環(huán)境中都有可能產(chǎn)生過(guò)量ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激現(xiàn)象發(fā)生，可嚴(yán)重影響早期胚胎的發(fā)育[1]。我們選擇最常研究的1-細(xì)胞胚和8-細(xì)胞胚為研究對(duì)象，以H2O2誘導(dǎo)小鼠體外培養(yǎng)的早期胚胎的氧化損傷，探討哪個(gè)階段的早期胚胎對(duì)氧化損傷更為敏感，為后續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)體系、提高囊胚獲取率提供理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明（KM）小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（雌鼠4～6w，雄鼠8w以上），繼續(xù)飼養(yǎng)3～5d，調(diào)節(jié)生理周期，使其適應(yīng)環(huán)境供實(shí)驗(yàn)處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

KM雌鼠腹腔注射10IU PMSG，48h后注射10IU hCG，隨后與KM雄鼠1:1合籠，次日清晨檢查陰栓判斷是否受精。分別于hCG注射后27h，從有陰栓雌鼠輸卵管中收集1-細(xì)胞胚；于hCG注射后66h，從有陰栓雌鼠輸卵管和子宮中收集8-細(xì)胞胚。經(jīng)M2洗滌，KSOM培養(yǎng)液漂洗3次，挑取形態(tài)完好的1-細(xì)胞胚和8-細(xì)胞胚移至KSOM和H2O2處理微滴中，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min，而后將早期胚胎細(xì)胞從微滴中移出，KSOM培養(yǎng)液分別洗滌3次，再移入預(yù)平衡好的KSOM培養(yǎng)微滴中繼續(xù)培養(yǎng)，于hCG后42h、66h（體外培養(yǎng)相對(duì)較體內(nèi)發(fā)育速度慢，hCG后66h體外培養(yǎng)的多數(shù)處于4-細(xì)胞期，體內(nèi)發(fā)育的多數(shù)為8-細(xì)胞期）、96h和120h觀察和記錄早期胚胎發(fā)育情況，每組重復(fù)3次以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 H2O2對(duì)KM小鼠1-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響

表2 H2O2對(duì)KM小鼠8-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響

KM小鼠1-細(xì)胞胚和8-細(xì)胞胚經(jīng)不同濃度的H2O2（1-細(xì)胞胚處理濃度為20、30、40和60μM；8-細(xì)胞胚處理濃度為0、30、60、100和200μM）處理，與對(duì)照組相比，1-細(xì)胞胚處理組結(jié)果：20μM處理組，發(fā)育到2-8細(xì)胞階段的發(fā)育率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但囊胚發(fā)育率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他組各階段發(fā)育率均有顯著差別，60μM處理組則發(fā)育完全阻滯；8-細(xì)胞胚處理組結(jié)果：30μM處理組其囊胚發(fā)育率差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，60μM處理組囊胚發(fā)育率仍有68.52%，200μM處理組發(fā)育完全阻滯。

3.討論

少量ROS在配子成熟、受精和胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。但是，ROS的過(guò)量產(chǎn)生，這可能誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，核DNA斷裂和線粒體改變等，從而影響植入前胚的發(fā)育。例如，Liu等研究顯示ROS蓄積使線粒體活性和結(jié)構(gòu)改變而誘發(fā)胚胎發(fā)育阻滯[2]。在小鼠1-細(xì)胞胚中加入H2O2可誘導(dǎo)建立胚胎氧化損傷模型。本研究結(jié)果顯示：在1-細(xì)胞胚中加入20μM H2O2可引起囊胚發(fā)育率下降，60μM導(dǎo)致發(fā)育完全阻滯，也驗(yàn)證了H2O2可誘導(dǎo)建立胚胎氧化損傷模型。

在8-細(xì)胞胚中，30μM處理組其囊胚發(fā)育率差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，60μM處理組囊胚發(fā)育率仍有68.52%，對(duì)桑椹胚的形成則幾乎沒(méi)有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：體外培養(yǎng)小鼠早期胚胎對(duì)H2O2造成的氧化應(yīng)激在1-細(xì)胞期比8-細(xì)胞期更為敏感。小鼠體外發(fā)育阻滯與小鼠合子型基因組激活緊密相關(guān)，1-2細(xì)胞胚正處于合子基因組激活時(shí)期，因而體外培養(yǎng)1-細(xì)胞胚只需較低濃度的H2O2即可引起細(xì)胞發(fā)育阻滯，而8-細(xì)胞胚時(shí)期，已完成母型-合子型過(guò)渡，這段時(shí)間內(nèi)敏感性下降，因此需較高濃度的H2O2才會(huì)引起細(xì)胞發(fā)育阻滯。另外，有研究顯示多種抗氧化酶基因表達(dá)水平在小鼠胚胎2-細(xì)胞期均較低[3]，而在體外培養(yǎng)的小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的ROS在2-細(xì)胞期時(shí)卻大幅度升高[4]，體外培養(yǎng)的1-2細(xì)胞胚承受較高的ROS而自身的清除能力卻不足，所以本研究增加少量H2O2即可誘發(fā)發(fā)育阻滯。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著H2O2濃度的提高，發(fā)育阻滯主要發(fā)生于1-細(xì)胞到2-細(xì)胞的過(guò)渡，以及2-細(xì)胞到4-細(xì)胞的過(guò)渡，進(jìn)一步證實(shí)小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯可能與氧化損傷有關(guān)。因此，為了提高獲取率，我們可以對(duì)氧化損傷敏感的1-細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究如何減少小鼠體外培養(yǎng)早期胚胎的氧化損傷以及如何抵抗氧化損傷，提高體外培養(yǎng)的囊胚獲取率。