王丹 肖凌 江紹偉
(1中國(guó)人民解放軍第一六一醫(yī)院 湖北 武漢 430000)
(2湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 湖北 武漢 430065)
結(jié)腸癌的發(fā)病率以及死亡率是我國(guó)惡性腫瘤的第三位,治療手段主要以手術(shù)切除為主,同時(shí)聯(lián)合化療、放療來(lái)降低復(fù)發(fā)率,提高生存率。結(jié)腸癌的化療毒副作用大。中藥有高效低毒的特點(diǎn),近年來(lái)在腫瘤的后期治療中起到一定的作用[1]。苦參堿是中藥苦參的主要活性成分之一,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)主要研究MA對(duì)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的致凋亡作用,探討其對(duì)結(jié)腸癌可能的作用機(jī)制,為中藥在腫瘤治療方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。
人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞由湖北省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供??鄥A購(gòu)自Sigma公司,用RPM1640(美國(guó)Gibco公司)助溶,終濃度為200mg/ml,0.22濾器除菌,-20℃保存,臨用時(shí)加培養(yǎng)液稀釋至所需濃度;二甲基亞砜(DMSO)﹑噻唑藍(lán)(MTT)為南京凱基公司產(chǎn)品;其他試劑購(gòu)自廣州瑞博公司。
結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%的小牛血清),置37℃、5% CO2孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng) 。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,采用0.25%胰酶消化后,將細(xì)胞密度調(diào)整為l×l05/ml。以每孔200μL接種于微孔板,分別加入苦參堿,終質(zhì)量濃度分別為2、4、8、16和32mg/ml,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)24,36和48小時(shí),對(duì)照組僅加等量的培養(yǎng)液。每孔加 MTT(5g/L)20μl,培養(yǎng)4h后,棄去培養(yǎng)基,加150mL的DMSO溶液,輕輕振蕩約10min后,酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處 測(cè)吸光度(A),根據(jù)公式(細(xì)胞增殖率=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)計(jì)算細(xì)胞增殖率。
有絲分裂評(píng)估細(xì)胞死亡率,將不同濃度苦參堿的細(xì)胞懸液(1×105個(gè)細(xì)胞)與磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在4℃下混合,12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。70%乙醇溶液重懸浮,4℃溫育過(guò)夜。收集上清液細(xì)胞,室溫下重懸于500μLPI溶液(含有0.2% Triton X-100的PBS,50μg/ml的PI和100μg/ml的RNase A)。30分鐘后,采用Cell Quest軟件,使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定有絲分裂狀態(tài)。
以4、8、16mg/ml MA處理人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞24h,分別消化收集各組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml,4℃ PBS洗滌兩次后,棄上清液;加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液100μl重懸細(xì)胞,置冰??;加入10μl annexin V-FITC和10μl20μg/ml PI于細(xì)胞懸液中,輕輕混勻;將試管置于室溫避光染色15min;補(bǔ)加400μl結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)、分析細(xì)胞凋亡的百分比。
培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)PBS處理,用含有10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM NaCl,175mM蔗糖和12.5mM EDTA的緩沖液中超聲處理細(xì)胞來(lái)分離線粒體和細(xì)胞質(zhì),將細(xì)胞提取物以1000×g離心10分鐘棄沉淀,轉(zhuǎn)移上清再以18000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,所得上清即作胞質(zhì)部分和對(duì)應(yīng)所得的沉淀即為胞質(zhì)對(duì)應(yīng)的粗制線粒體部分。通過(guò)Bradford方法在兩個(gè)級(jí)分中測(cè)量蛋白質(zhì)含量。通過(guò)15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì),并電轉(zhuǎn)移至NC膜上。NC膜以封閉液室溫孵育3h后,取出放入一抗工作液中孵育,4℃過(guò)夜,以TBST洗膜(5min×3次)后,放入AP標(biāo)記的二抗工作液中孵育,室溫2h,再以TBST洗膜(3min×5次),然后水洗,并放入以BBT/BCIP試劑盒新鮮配制AP顯色液中顯色,流水洗滌終止顯色,掃描NC膜上顯色條帶,并采用Quantity One軟件分析。
采用分光光度法檢測(cè)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞caspase-3,-9酶活性,以4、8、16mg/ml MA,作用細(xì)胞24h后收集各組細(xì)胞,按caspase-3,-9檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。酶標(biāo)儀在λ=405nm測(cè)定其光密度(D)值。用D實(shí)驗(yàn)組/D對(duì)照組的比值表示caspase活化程度。
將細(xì)胞經(jīng)不同濃度的MA處理24h后,消化并收集細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液100μl后,經(jīng)4℃ 12000rpm離心10min。將等量樣品(30μg/ml)經(jīng)12.5% SDS–PAGE膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上。先加入一抗工作液過(guò)夜,再加入二抗工作液。洗膜加ECL化學(xué)顯影劑,X光片曝光顯結(jié)果。
采用用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析,統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析和t檢驗(yàn),P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2mg/ml苦參堿作用Caco-2 Cells細(xì)胞24、36、48小時(shí)細(xì)胞增殖率分別為9.8%,19%,28%;4 mg/ml時(shí)分別為11%,35%,50%;8mg/ml時(shí)分別為32%,49%,60%;8 mg/ml時(shí)分別為38%,49%,61%,16mg/ml時(shí)分別為52%60%,68%;32mg/ml時(shí)分別為58%,68%,75%;不同濃度Matrine 對(duì)Caco-2 Cells細(xì)胞增殖均有不同程度地抑制,且呈濃度依賴性(P<0.05)。
如圖1所示,隨著濃度地增加細(xì)胞在G0/G1期明顯增加,在G2/M期顯著降低,這一結(jié)果表明苦參堿阻滯G0/G1期Caco-2細(xì)胞,S和G2/M期細(xì)胞減少。
圖1
因本研究使用PI的組織化學(xué)分析來(lái)分離凋亡的初始階段與壞死。在用FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)試了不同階段的細(xì)胞比例,包括活細(xì)胞死亡或凋亡相。結(jié)果如圖2所示?;铙w細(xì)胞在左下象限(不含膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色)中鑒定。早期的細(xì)胞在右下象限(Annexin V-FITC陽(yáng)性)中發(fā)現(xiàn)。晚期凋亡的特征在于膜和核泡沫的存在,并且在該階段的細(xì)胞在右上象限中發(fā)現(xiàn)(膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI的雙染色)。結(jié)果表明隨著苦參堿劑量的增加,早期和晚期凋亡增加。晚期凋亡細(xì)胞的比例高于早期凋亡細(xì)胞的比例。
圖2
細(xì)胞凋亡刺激引發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素c進(jìn)入胞質(zhì)溶膠。蛋白質(zhì)印跡分析顯示細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c含量增加(圖3)。
圖3
Western印跡結(jié)果表明,在4至16mg/ml的劑量范圍內(nèi),Bcl-2表達(dá)下調(diào)和Bax水平增強(qiáng),Bcl-2/Bax比例降低(圖3)。
胱天蛋白酶是介導(dǎo)凋亡致死階段的半胱氨酸蛋白酶??鄥A能夠增強(qiáng)其前體活化的半胱天冬酶-9和-3的產(chǎn)生(圖4)。
圖4
在本研究中,使用結(jié)腸癌細(xì)胞系在體外建立苦參堿的抗癌作用,如MTT測(cè)定所示,采用2~32mg/ml苦參堿時(shí),Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)以劑量依賴性方式被阻斷。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示Caco-2細(xì)胞在G0/G1期生長(zhǎng)停滯,S期和G2-M期細(xì)胞減少。
細(xì)胞凋亡不僅介導(dǎo)正常生理,還介導(dǎo)多種疾病的病理生理。凋亡和增殖不平衡導(dǎo)致腫瘤發(fā)展和進(jìn)展[2]。促凋亡特性Bcl-2組蛋白,包括其他成員中的抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bax,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[3]。Bcl-2抑制細(xì)胞色素c的分泌,而不破壞外線粒體膜。Bax促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放。在本研究中,苦參堿治療下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax,從而增加線粒體膜的通透性。免疫印跡顯示苦參堿通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)水平來(lái)干擾體外結(jié)腸癌細(xì)胞。
胱天蛋白酶介導(dǎo)凋亡的致死階段。外因和內(nèi)在信號(hào)通路分別由caspases-8和-9誘導(dǎo)。通過(guò)線粒體蛋白簇切除Procaspase-8。此外,胱天蛋白酶-3作為關(guān)鍵酶涉及凋亡,已知通過(guò)DNA修復(fù)分子的切割誘導(dǎo)凋亡,抗凋亡蛋白的降解,細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解修飾,特異性多肽的骨架表達(dá)和其他分子。在本研究中,發(fā)現(xiàn)苦參堿處理誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的線粒體釋放,并最終增加caspase-3的活性。半胱天冬酶-3表達(dá)為35kDa無(wú)活性的前體(procaspase-3),其被激活至17-kDa酶。凋亡的Caco-2細(xì)胞在4-16mg/ml的劑量范圍內(nèi)苦參堿后顯示增加的活化的半胱天冬酶-3的水平。
本研究的結(jié)果表明,苦參堿可以預(yù)防體外人結(jié)腸癌細(xì)胞的進(jìn)展。苦參堿通過(guò)降低Bcl-2/Bax比例誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,并增加胱天蛋白酶-3和-9的活化。因此,苦參堿可用于人結(jié)腸癌輔助治療。