王丹 肖凌 江紹偉

（1中國(guó)人民解放軍第一六一醫(yī)院 湖北 武漢 430000）

（2湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 湖北 武漢 430065）

結(jié)腸癌的發(fā)病率以及死亡率是我國(guó)惡性腫瘤的第三位，治療手段主要以手術(shù)切除為主，同時(shí)聯(lián)合化療、放療來(lái)降低復(fù)發(fā)率，提高生存率。結(jié)腸癌的化療毒副作用大。中藥有高效低毒的特點(diǎn)，近年來(lái)在腫瘤的后期治療中起到一定的作用[1]。苦參堿是中藥苦參的主要活性成分之一，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)主要研究MA對(duì)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的致凋亡作用，探討其對(duì)結(jié)腸癌可能的作用機(jī)制，為中藥在腫瘤治療方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞由湖北省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供?？鄥A購(gòu)自Sigma公司，用RPM1640（美國(guó)Gibco公司）助溶，終濃度為200mg/ml，0.22濾器除菌，-20℃保存，臨用時(shí)加培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；二甲基亞砜（DMSO）﹑噻唑藍(lán)（MTT）為南京凱基公司產(chǎn)品；其他試劑購(gòu)自廣州瑞博公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和MTT測(cè)定

結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%的小牛血清），置37℃、5% CO2孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng) 。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，采用0.25%胰酶消化后，將細(xì)胞密度調(diào)整為l×l05/ml。以每孔200μL接種于微孔板，分別加入苦參堿，終質(zhì)量濃度分別為2、4、8、16和32mg/ml，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24，36和48小時(shí)，對(duì)照組僅加等量的培養(yǎng)液。每孔加 MTT（5g/L）20μl，培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)基，加150mL的DMSO溶液，輕輕振蕩約10min后，酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處 測(cè)吸光度（A），根據(jù)公式（細(xì)胞增殖率=A實(shí)驗(yàn)組／A對(duì)照組）計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3 有絲分裂

有絲分裂評(píng)估細(xì)胞死亡率，將不同濃度苦參堿的細(xì)胞懸液（1×105個(gè)細(xì)胞）與磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）在4℃下混合，12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。70%乙醇溶液重懸浮，4℃溫育過(guò)夜。收集上清液細(xì)胞，室溫下重懸于500μLPI溶液（含有0.2% Triton X-100的PBS，50μg/ml的PI和100μg/ml的RNase A）。30分鐘后，采用Cell Quest軟件，使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定有絲分裂狀態(tài)。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

以4、8、16mg/ml MA處理人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞24h，分別消化收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，4℃ PBS洗滌兩次后，棄上清液；加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液100μl重懸細(xì)胞，置冰??；加入10μl annexin V-FITC和10μl20μg/ml PI于細(xì)胞懸液中，輕輕混勻；將試管置于室溫避光染色15min；補(bǔ)加400μl結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)、分析細(xì)胞凋亡的百分比。

1.5 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞色素c水平

培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)PBS處理，用含有10mM Tris-HCl（pH7.5），10mM NaCl，175mM蔗糖和12.5mM EDTA的緩沖液中超聲處理細(xì)胞來(lái)分離線粒體和細(xì)胞質(zhì)，將細(xì)胞提取物以1000×g離心10分鐘棄沉淀，轉(zhuǎn)移上清再以18000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，所得上清即作胞質(zhì)部分和對(duì)應(yīng)所得的沉淀即為胞質(zhì)對(duì)應(yīng)的粗制線粒體部分。通過(guò)Bradford方法在兩個(gè)級(jí)分中測(cè)量蛋白質(zhì)含量。通過(guò)15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的蛋白質(zhì)，并電轉(zhuǎn)移至NC膜上。NC膜以封閉液室溫孵育3h后，取出放入一抗工作液中孵育，4℃過(guò)夜，以TBST洗膜（5min×3次）后，放入AP標(biāo)記的二抗工作液中孵育，室溫2h，再以TBST洗膜（3min×5次），然后水洗，并放入以BBT/BCIP試劑盒新鮮配制AP顯色液中顯色，流水洗滌終止顯色，掃描NC膜上顯色條帶，并采用Quantity One軟件分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析

采用分光光度法檢測(cè)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞caspase-3，-9酶活性，以4、8、16mg/ml MA，作用細(xì)胞24h后收集各組細(xì)胞，按caspase-3，-9檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。酶標(biāo)儀在λ=405nm測(cè)定其光密度（D）值。用D實(shí)驗(yàn)組/D對(duì)照組的比值表示caspase活化程度。

1.7 Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2的表達(dá)

將細(xì)胞經(jīng)不同濃度的MA處理24h后，消化并收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液100μl后，經(jīng)4℃ 12000rpm離心10min。將等量樣品（30μg/ml）經(jīng)12.5% SDS–PAGE膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上。先加入一抗工作液過(guò)夜，再加入二抗工作液。洗膜加ECL化學(xué)顯影劑，X光片曝光顯結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 Matrine 對(duì)Caco-2 Cells細(xì)胞增殖的抑制作用

2mg/ml苦參堿作用Caco-2 Cells細(xì)胞24、36、48小時(shí)細(xì)胞增殖率分別為9.8%，19%，28%；4 mg/ml時(shí)分別為11%，35%，50%；8mg/ml時(shí)分別為32%，49%，60%；8 mg/ml時(shí)分別為38%，49%，61%，16mg/ml時(shí)分別為52%60%，68%；32mg/ml時(shí)分別為58%，68%，75%；不同濃度Matrine 對(duì)Caco-2 Cells細(xì)胞增殖均有不同程度地抑制，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。

2.2 流式細(xì)胞儀分析Martine 對(duì)細(xì)胞周期的影響

如圖1所示，隨著濃度地增加細(xì)胞在G0/G1期明顯增加，在G2/M期顯著降低，這一結(jié)果表明苦參堿阻滯G0/G1期Caco-2細(xì)胞，S和G2/M期細(xì)胞減少。

圖1

2.3 凋亡檢測(cè)

因本研究使用PI的組織化學(xué)分析來(lái)分離凋亡的初始階段與壞死。在用FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)試了不同階段的細(xì)胞比例，包括活細(xì)胞死亡或凋亡相。結(jié)果如圖2所示?；铙w細(xì)胞在左下象限（不含膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色）中鑒定。早期的細(xì)胞在右下象限（Annexin V-FITC陽(yáng)性）中發(fā)現(xiàn)。晚期凋亡的特征在于膜和核泡沫的存在，并且在該階段的細(xì)胞在右上象限中發(fā)現(xiàn)（膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI的雙染色）。結(jié)果表明隨著苦參堿劑量的增加，早期和晚期凋亡增加。晚期凋亡細(xì)胞的比例高于早期凋亡細(xì)胞的比例。

圖2

2.4 細(xì)胞色素c釋放

細(xì)胞凋亡刺激引發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素c進(jìn)入胞質(zhì)溶膠。蛋白質(zhì)印跡分析顯示細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c含量增加（圖3）。

圖3

2.5 Bax和Bcl-2表達(dá)水平

Western印跡結(jié)果表明，在4至16mg/ml的劑量范圍內(nèi)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)和Bax水平增強(qiáng)，Bcl-2/Bax比例降低（圖3）。

2.6 上調(diào)caspase-9和-3

胱天蛋白酶是介導(dǎo)凋亡致死階段的半胱氨酸蛋白酶?？鄥A能夠增強(qiáng)其前體活化的半胱天冬酶-9和-3的產(chǎn)生（圖4）。

圖4

3.討論

在本研究中，使用結(jié)腸癌細(xì)胞系在體外建立苦參堿的抗癌作用，如MTT測(cè)定所示，采用2～32mg/ml苦參堿時(shí)，Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)以劑量依賴性方式被阻斷。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示Caco-2細(xì)胞在G0/G1期生長(zhǎng)停滯，S期和G2-M期細(xì)胞減少。

細(xì)胞凋亡不僅介導(dǎo)正常生理，還介導(dǎo)多種疾病的病理生理。凋亡和增殖不平衡導(dǎo)致腫瘤發(fā)展和進(jìn)展[2]。促凋亡特性Bcl-2組蛋白，包括其他成員中的抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bax，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[3]。Bcl-2抑制細(xì)胞色素c的分泌，而不破壞外線粒體膜。Bax促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放。在本研究中，苦參堿治療下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax，從而增加線粒體膜的通透性。免疫印跡顯示苦參堿通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)水平來(lái)干擾體外結(jié)腸癌細(xì)胞。

胱天蛋白酶介導(dǎo)凋亡的致死階段。外因和內(nèi)在信號(hào)通路分別由caspases-8和-9誘導(dǎo)。通過(guò)線粒體蛋白簇切除Procaspase-8。此外，胱天蛋白酶-3作為關(guān)鍵酶涉及凋亡，已知通過(guò)DNA修復(fù)分子的切割誘導(dǎo)凋亡，抗凋亡蛋白的降解，細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解修飾，特異性多肽的骨架表達(dá)和其他分子。在本研究中，發(fā)現(xiàn)苦參堿處理誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的線粒體釋放，并最終增加caspase-3的活性。半胱天冬酶-3表達(dá)為35kDa無(wú)活性的前體（procaspase-3），其被激活至17-kDa酶。凋亡的Caco-2細(xì)胞在4-16mg/ml的劑量范圍內(nèi)苦參堿后顯示增加的活化的半胱天冬酶-3的水平。

本研究的結(jié)果表明，苦參堿可以預(yù)防體外人結(jié)腸癌細(xì)胞的進(jìn)展。苦參堿通過(guò)降低Bcl-2/Bax比例誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，并增加胱天蛋白酶-3和-9的活化。因此，苦參堿可用于人結(jié)腸癌輔助治療。