朱旭峰 王俊玲

（山西省汾陽(yáng)醫(yī)院 山西 汾陽(yáng) 032200）

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是引起新生兒先天性感染的主要病原體之一[1]，并可以導(dǎo)致新生兒表現(xiàn)多種臨床癥狀，包括：新生兒黃疸消退延遲、神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、聽(tīng)力障礙、肝功能異常，貧血等[2]。多樣的臨床癥狀必須結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行診斷，并有效地治療HCMV感染的疾病，這對(duì)檢測(cè)方的時(shí)間的長(zhǎng)短、結(jié)果的準(zhǔn)確性提出更高的要求。本研究中采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法對(duì)患兒的尿液及其母乳中HCMV-DNA進(jìn)行定量定性檢測(cè)，進(jìn)而可以探討FQ-PCR的檢測(cè)方法對(duì)嬰幼兒HCMV感染診斷中的意義。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年7月1日至2018年6月8日在山西省汾陽(yáng)醫(yī)院就診的疑似HCMV感染的患兒尿液和其母乳標(biāo)本，尿液標(biāo)本為54例，乳液標(biāo)本為68例；年齡1d至2歲。根據(jù)兒童的年齡特點(diǎn)分為≥1月組，1月～1歲組，＜1歲組。

1.2 標(biāo)本采集

初診次日上午用分別收集兒童的尿液及其母親的乳液送檢，不能及時(shí)送檢的樣本暫時(shí)放在4℃冰箱保存，采集過(guò)程中必須用無(wú)菌離心管。

1.3 儀器與試劑

檢測(cè)使用儀器是美國(guó)ABI7500型熒光定量PCR儀，試劑為達(dá)安基因股份有限公司的人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光法，Cat：#DA-d061）。

1.4 檢測(cè)方法

嚴(yán)格按照熒光定量PCR檢測(cè)HCMV-DNA按試劑說(shuō)明書(shū)操作。分別取乳液和尿液1ml存于配套的無(wú)菌離心管中，在轉(zhuǎn)速為12000r/min的條件下，離心5min后，去上清，向沉淀中加DNA提取液50μL混勻后置于100℃水浴10min，同樣轉(zhuǎn)速下離心5min后取5μL做模板進(jìn)行相應(yīng)的定量PCR擴(kuò)增。

分別取5μL處理后的標(biāo)準(zhǔn)品（包括陽(yáng)性，弱陽(yáng)性，陰性標(biāo)準(zhǔn)品）和標(biāo)本DNA模板于PCR管中，放入PCR儀器樣品槽中并根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反應(yīng)：93℃ 2min，93℃ 45s→55℃60s→10個(gè)循環(huán)，93℃ 30s→55℃ 45s→30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析計(jì)算定量結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 尿液和母乳標(biāo)本的檢測(cè)陽(yáng)性率比較

根據(jù)兩種標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率的比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=36.27，P＜0.0001），見(jiàn)表1。

表1 尿液和母乳標(biāo)本中HCMV-DNA FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 配比檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：尿液陽(yáng)性率分別為17.8%（8/45），而母乳的陽(yáng)性率為68.9%（31/45）（表2）；兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.39，P＜0.05）。

表245例尿液和母乳標(biāo)本HCMV-DNA FQ-PCR配對(duì)檢測(cè)結(jié)果

3.討論

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）屬于皰疹病毒科，是一種DNA病毒，對(duì)宿主具有高度的種屬選擇性，而且僅在人與人之間進(jìn)行傳播。HCMV的感染現(xiàn)象極其普遍，在我國(guó)約有95%以上的人群感染人巨細(xì)胞病毒，目前，臨床實(shí)驗(yàn)室中對(duì)HCMV感染的檢測(cè)方法有很多，主要有：病毒培養(yǎng)、抗體檢測(cè)和抗原檢測(cè)，但其均具有一定的局限性，病毒培養(yǎng)檢測(cè)主要是HCMV分離，從唾液或尿液中分離病毒培養(yǎng)，通過(guò)普通顯微鏡觀察鑒定是否有HCMV感染。該方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，而且靈敏度低。抗體檢測(cè)主要對(duì)宿主血清中HCMV-IgG和HCMV-IgM進(jìn)行檢測(cè)，由于我國(guó)是HCMV感染的高發(fā)地區(qū)，HCMV-IgG抗體的陽(yáng)性率高于90%，根據(jù)IgG的檢測(cè)結(jié)果無(wú)法確定是否為近期感染；IgM是HCMV感染宿主后產(chǎn)生的，但有些免疫功能不完善的嬰幼兒在感染HCMV后產(chǎn)生的IgM量很少，很容易出現(xiàn)假陰性，因此，該檢測(cè)方法不適用于嬰幼兒早期診斷。

本結(jié)果顯示：出生時(shí)間為1月～1歲的嬰幼兒母乳檢出率和尿液檢出率相等，而出生一個(gè)月之內(nèi)的嬰幼兒母乳HCMV陽(yáng)性檢出率強(qiáng)于尿液的檢出率，通過(guò)FQ-PCR法檢測(cè)母乳中HCMV感染程度，對(duì)于先天、后天免疫功能低下或用免疫抑制劑的患兒有指示作用。