徐微

吉林省結(jié)核病醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林長(zhǎng)春 130500

非結(jié)核分枝桿菌是指結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌與牛分枝桿菌以外的分枝桿菌，其特征與結(jié)核分枝桿菌有明顯差異，現(xiàn)已備受各界學(xué)者的關(guān)注[1]。目前，臨床主要通過(guò)抗酸染色法、羅氏法等進(jìn)行結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌診斷，然而抗酸染色法鑒別效果較差，羅氏法雖然準(zhǔn)確率較高，但檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜，無(wú)法為患者早期診療工作提供保障[2]。因此，探尋一種快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法鑒別各類型分支桿菌十分必要。該研究隨機(jī)選擇2016年12月—2018年3月該院痰結(jié)核培養(yǎng)或結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本108份，采用博奧生物有限公司生產(chǎn)的DNA-微陣列芯片法進(jìn)行檢驗(yàn)，并與改良羅氏法與測(cè)序法對(duì)比，探討DNA-微陣列芯片法對(duì)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇該院痰結(jié)核培養(yǎng)或結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本108份，其中痰培養(yǎng)陽(yáng)性48份，痰涂片陽(yáng)性60份。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 主要儀器：E-Cycler96梯度PRC儀，BioMixerII芯片雜交儀，Extractor36核酸快速提取儀，Luxscan10K-B微陣列芯片掃描儀。試劑：噻吩-2-羧酸肼、對(duì)硝基苯甲酸與改良羅氏培養(yǎng)基均由天津金章科技發(fā)展有限公司提供，DNA-微陣列芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒由北京博奧生物有限公司提供。

1.2.2 檢驗(yàn)方法 108份標(biāo)本均采用改良羅氏培養(yǎng)法、DNA-微陣列芯片法檢驗(yàn)，對(duì)二者檢驗(yàn)結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，并將結(jié)果作為檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。⑴改良羅氏培養(yǎng)法：通過(guò)對(duì)硝基苯甲酸生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)初步鑒定菌種，識(shí)別出的結(jié)核分枝桿菌菌株，并以絕對(duì)濃度法給予分枝桿菌藥物敏感檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法根據(jù)中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制定的 《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》執(zhí)行。⑵DNA-微陣列芯片法檢驗(yàn)：根據(jù)試劑說(shuō)明書中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)操作。①核酸提?。哼x取核酸提取液80 μL并置于提取管中，加入無(wú)菌接種環(huán)挑取的涂片陽(yáng)性痰液或培養(yǎng)陽(yáng)性菌落。通過(guò)核酸快速提取儀進(jìn)行震蕩，時(shí)間為5 min，再以90℃水浴 5 min，速度5 000 rpm離心1 min，取出核酸放置在-20℃的冰箱內(nèi)待檢。②PCR擴(kuò)增：在每個(gè)樣品上設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。在200 μL離心管內(nèi)加入PCR擴(kuò)增試劑1～3各18 μL，并在3個(gè)離心管內(nèi)加入包含待檢樣品DNA的核酸提取管內(nèi)上清液2 μL，放置在PCR擴(kuò)增儀中，根據(jù)說(shuō)明書內(nèi)的熱循環(huán)流程給予PCR擴(kuò)增。PCR引物序列均由博奧生物有限公司提供，其中PCR擴(kuò)增試劑1～3擴(kuò)增分別為分枝桿菌屬探針序列，rpoB基因突變位點(diǎn)序列，inhA與katG基因突變位點(diǎn)序列。③芯片雜交：加熱雜交緩沖液，溫度控制在50℃，待其完全融化合混勻后，分別取9 μL放置在2管內(nèi)。各取3 μL PCR1與2產(chǎn)物加入上述2個(gè)雜交緩沖液管內(nèi)，配制成混合物R。各取3 μL PCR1與3產(chǎn)物配制混合物H。加熱雜交混合物，溫度為95℃，使其變性5 min，之后冰浴3 min。在加樣孔內(nèi)加入13.5 μL混合物，微陣列1加入混合物R，微陣列2加入H，密封放置在溫水（50℃）浴鍋內(nèi)120 min。④洗滌與干燥：拆開雜交盒，取出芯片放置在包含芯片洗滌液Ⅰ的容器內(nèi)，以80～100 rpm的速度恒溫振蕩，洗滌3 min。之后以80～100 rpm的速度恒溫振蕩芯片洗滌液Ⅱ，洗滌3 min。最后將芯片放置在離心機(jī)內(nèi)，以800 rpm的速度離心5 min，甩干后掃描。⑤掃描與結(jié)果讀?。和ㄟ^(guò)微陣列芯片掃描儀與相關(guān)軟件讀取信號(hào)與結(jié)果。⑶測(cè)序：將改良羅氏培養(yǎng)與DNA-微陣列芯片法檢驗(yàn)不一致的標(biāo)本進(jìn)行DNA序列檢驗(yàn)，利用博奧生物有限公司生產(chǎn)試劑盒中的引物作為測(cè)序上下游引物。

1.3 觀察指標(biāo)

將測(cè)序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)改良羅氏法、DNA-微陣列芯片法對(duì)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別效果。改良羅氏培養(yǎng)法鑒別標(biāo)準(zhǔn)：選取羅氏培養(yǎng)基上單個(gè)菌落實(shí)施噻吩-2-羧酸肼與對(duì)硝基苯甲酸檢驗(yàn)，當(dāng)噻吩-2-羧酸肼（+），對(duì)硝基苯甲酸（-）時(shí)為結(jié)核分枝桿菌；當(dāng)噻吩-2-羧酸肼（+），對(duì)硝基苯甲酸（+）時(shí)為非結(jié)核分枝桿菌。DNA-微陣列芯片法鑒別標(biāo)準(zhǔn)：按照芯片上探針在特定位置的排布，讀取受檢細(xì)胞的信息，繼而鑒定出分枝桿菌菌種。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

該研究數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，以 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

108份標(biāo)本經(jīng)測(cè)序結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌26份，非結(jié)核分枝桿菌82份。經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)法檢驗(yàn)，鑒定為結(jié)核分枝桿菌25份，非結(jié)核分枝桿菌80份；經(jīng)DNA-微陣列芯片法檢驗(yàn)，鑒定為結(jié)核分枝桿菌24份，非結(jié)核分枝桿菌79份，其中包括戈登分枝桿菌16份，胞內(nèi)分枝桿菌30份，堪薩斯分枝桿菌10份，偶然分枝桿菌5份，復(fù)合群鳥分枝桿菌10份，無(wú)法讀取8份。經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)法檢驗(yàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確率為96.15%、97.56%，與DNA-微陣列芯片92.31%、96.34%對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 改良羅氏法、DNA-微陣列芯片法對(duì)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別效果對(duì)比[n（%）]

3 討論

分枝桿菌屬于細(xì)菌的一大類，其包含不同的細(xì)菌菌種，結(jié)核分枝桿菌可導(dǎo)致人類罹患結(jié)核病，非結(jié)核分枝桿菌則是分枝桿菌類目下的細(xì)菌，不是導(dǎo)致結(jié)核病的原因[3]。近年來(lái)，非結(jié)核分枝桿菌的感染率顯著攀升，且感染種類也不斷增加，現(xiàn)已備受臨床學(xué)者的關(guān)注[4]。由于致病性非結(jié)核分枝桿菌感染與結(jié)核病癥狀相似，均存在全身癥狀與局部損害，且二者影像學(xué)表現(xiàn)十分相近，極易發(fā)生誤診，延誤治療時(shí)機(jī)[5]。

目前，改良羅氏法是鑒別結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的主要檢驗(yàn)方法，可以直觀觀察到細(xì)菌的生長(zhǎng)。然而，部分研究發(fā)現(xiàn)，改良羅氏法易受菌齡、菌量與受檢者主觀因素的影響，加之檢驗(yàn)周期長(zhǎng)（通常從患者就診到獲取到敏感結(jié)果需要2～3個(gè)月）、操作復(fù)雜，無(wú)法為患者提供早期診斷依據(jù)[6-7]。目前，分子生物學(xué)技術(shù)是熱門的快速檢驗(yàn)方法。DNA-微陣列芯片法與線性探針相似，其技術(shù)特點(diǎn)是通過(guò)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物與寡核苷酸探針，在芯片表現(xiàn)上固定，并經(jīng)與針對(duì)性擴(kuò)增受檢樣本的DNA片段雜交，利用芯片掃描儀對(duì)雜交后的芯片熒光信號(hào)進(jìn)行掃描，繼而讀取出菌種信息[8]。同時(shí)，DNA-微陣列芯片可在6 h得出檢驗(yàn)結(jié)果，操作簡(jiǎn)單、快速，并能夠同時(shí)鑒別17種分枝桿菌，有效保證了患者的治療時(shí)機(jī)。學(xué)者何建[9]對(duì)125例結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽(yáng)性標(biāo)本與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性標(biāo)本，應(yīng)用了DNA微陣列芯片法檢測(cè)耐藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)異煙肼耐藥的一致率為98.8%，對(duì)利福平的一致率為99.4%，并認(rèn)為DNA微陣列芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性效果可靠，且用時(shí)短，可用于臨床篩查。學(xué)者何莉等[10]對(duì)64例改良羅氏法陽(yáng)性分枝桿菌核酸應(yīng)用了DNA-微陣列芯片法檢測(cè)，并以測(cè)序法作為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)的一致率為93.8%，非結(jié)核分枝桿菌一致率95.8%，結(jié)核分枝桿菌一致率87.5%。該文研究結(jié)果與上述結(jié)果相符，改良羅氏培養(yǎng)法對(duì)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)的準(zhǔn)確率為96.15%、97.56%，與DNA-微陣列芯片92.31%、96.34%對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 可見，DNA-微陣列芯片與改良羅氏法鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的效果相當(dāng)，但DNA-微陣列芯片的檢驗(yàn)速度更快，為臨床診療提供了有利的參考。108份標(biāo)本中，DNA-微陣列芯片菌種顯示無(wú)法讀取5份，其中4份樣本在偶然分枝桿菌熒光探針處肉眼觀察到微弱的熒光信號(hào)，但因背景過(guò)亮，干擾了信號(hào)值的讀??；1份樣本不僅背景過(guò)亮，且熒光存在雜質(zhì)，導(dǎo)致熒光信號(hào)極弱。究其原因可以與以下幾項(xiàng)有關(guān)：①開始加樣-干燥芯片的某個(gè)環(huán)節(jié)中，芯片微陣列液體直接暴露在空氣中過(guò)久，樣本過(guò)于干燥而提高了芯片背景亮度；②實(shí)驗(yàn)樣本受到污染，導(dǎo)致芯片背景存在雜質(zhì)；③核酸濃度差異對(duì)結(jié)果讀取造成了干擾[10]。

綜上所述，DNA-微陣列芯片法在結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)中具有較高的準(zhǔn)確率，且操作簡(jiǎn)單、快速，臨床應(yīng)用價(jià)值顯著，適于推廣。