萬 盼,胡艷波,張弓喬,王宏翔,李錄林,王 鵬,惠剛盈,*

1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所,國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100091 2 甘肅省小隴山林業(yè)實(shí)驗(yàn)局林業(yè)科學(xué)研究所, 天水 741020

土壤微生物是土壤與植物的紐帶,在土壤生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)過程中起重要作用。土壤中細(xì)菌群落在微生物中所占比例很高,是土壤物質(zhì)循環(huán)的最主要參與者,其群落結(jié)構(gòu)和多樣性能夠反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化過程[1]。已有研究表明,土地利用方式的改變以及不同的管理措施,可以導(dǎo)致土壤微生物群落的改變,進(jìn)而影響土壤性質(zhì)和微環(huán)境[2- 3]。比如,Dong 等[4]表明,與傳統(tǒng)耕作方式相比,連作可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)不同植物下的土壤微生物群落多樣性均高于沙地土壤,說明土地利用方式可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；Annamaria等[6]研究表明,經(jīng)營(yíng)方式的不同也可以改變土壤細(xì)菌群落組成及其豐富度。

小隴山自然保護(hù)區(qū)是我國(guó)暖溫帶-亞熱帶過渡地帶,由于自然因素和人為因素的影響,導(dǎo)致該地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的退化。近年來,退耕還林政策的實(shí)施,大面積人工林在當(dāng)?shù)赝茝V,以期改善區(qū)域生態(tài)環(huán)境脆弱的現(xiàn)狀。我國(guó)特有樹種油松(PinustabulaeformisCarr.)是該區(qū)域退耕還林的主要樹種,近年來在小隴山發(fā)展迅速[7- 8]。柴胡(Bupleurumchinense)屬藥用植物,在小隴山自然保護(hù)區(qū),耕地被農(nóng)民用來長(zhǎng)期耕種柴胡,作為一種經(jīng)濟(jì)作物；而現(xiàn)在大面積的柴胡地普遍被改為培育油松苗。耕地變林地,土地利用方式的改變,相應(yīng)的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性也將發(fā)生變化[9]。Fierer[10]對(duì)北美到南美土壤微生物群落空間變異進(jìn)行研究,表明土壤細(xì)菌群落的多樣性和物種豐富度隨地上生態(tài)系統(tǒng)類型的變化而變化；Huang等[11]研究表明,黃土高原農(nóng)耕地植被的恢復(fù)能夠使得微生物群落結(jié)構(gòu)改變,改善了土壤生態(tài)。當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)油松苗的研究?jī)H集中在育苗栽培與造林技術(shù)[12]、林分生長(zhǎng)模型[13]和更新[14]等方面,因此,我們應(yīng)及時(shí)深入探究耕地上栽植油松苗后土壤微生物群落的變化情況,進(jìn)而了解土壤質(zhì)量的變化情況,這對(duì)當(dāng)?shù)貙?shí)現(xiàn)合理的植被管理和土地可持續(xù)利用具有重要意義。

新一代測(cè)序技術(shù)-高通量測(cè)序具有產(chǎn)生數(shù)據(jù)量大、測(cè)序周期短、準(zhǔn)確率高以及成本低等優(yōu)點(diǎn),在微生物生態(tài)學(xué)的研究中凸顯出明顯的優(yōu)越性[15- 18]。對(duì)此,本研究以小隴山典型的油松人工苗和柴胡作為對(duì)象,采用高通量測(cè)序方法,對(duì)常見的2種人工植被類型下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了分析,以期為當(dāng)?shù)剡M(jìn)行人工油松苗的種植、經(jīng)營(yíng)及土壤管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)域概況

小隴山林區(qū)位于甘肅省東南部,地處秦嶺西段,屬暖溫帶向北亞熱帶過渡地帶,兼有我國(guó)南北氣候特點(diǎn),大多數(shù)地域?qū)倥瘻貪駶?rùn)-中溫半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候[19]。年平均氣溫,極端最高氣溫39.2℃,極端最低氣溫-23.2℃,年降水600—900 mm,主要集中于7、8、9月,年蒸發(fā)989—1658 mm,相對(duì)濕度68%—78%,年日照時(shí)1520—2313 h,無霜期130—220 d,區(qū)內(nèi)秦嶺以北的地帶性土壤為灰褐土,以南為黃褐土,土壤垂直分布較明顯[20]。

2 研究方法

2.1 樣地設(shè)置與樣品采集

土壤采集于2017年5月進(jìn)行；選擇具有代表性的油松人工苗地和柴胡種植地各3塊面積為20 m×20 m的樣地,且各樣地之間環(huán)境條件相似、相距較近；樣地海拔基本相等(約為1365—1379 m),每個(gè)植被類型3個(gè)樣地分布在不同坡位,分別在上、中和下,坡度大約為12°—4°,坡向?yàn)槲髂稀２窈鳛橐环N藥用植物,在當(dāng)?shù)乇蛔鳛榻?jīng)濟(jì)作物長(zhǎng)期種植；油松是移栽至種植柴胡的耕地上,生長(zhǎng)期為4 a,其地徑、苗高和冠幅分別約為4.12、152.50、109.10 cm。柴胡和油松苗的管理方式相似：柴胡于每年6月人工施肥一次,7—8月人工除草一次；油松苗移栽至耕地,于每年開春、土壤解凍后施肥一次,分別在6、8月和10月進(jìn)行3次人工除草。

在每個(gè)樣地采用五點(diǎn)法取樣,先除去表層凋落物,采集表層(0—30 cm)土壤,多點(diǎn)均勻混合,混合土樣時(shí)剔除雜質(zhì),取一部分土壤樣品放入消毒無菌的自封袋,放在4℃冷藏箱保存并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室,放在-80℃冰箱中保存,用于土壤微生物多樣性分析；另外,再取一部分土壤樣品裝入自封袋,帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干后過篩用于土壤理化性質(zhì)分析。

2.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法；全氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定；全磷含量采用酸熔-鉬銻抗比色法測(cè)定；全鉀采用NaOH熔融、火焰光度法測(cè)定；堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；有效磷含量采用鹽酸-氟化銨提取-鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀含量采用乙酸銨浸提-火焰光度法測(cè)定。以上測(cè)定方法參見《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[21]。

2.3 土壤DNA 抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)MP-FastDNATMSpin kit for soil試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進(jìn)行總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè),利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG- 3′)和907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 3′) 引物對(duì)V3-V5可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性3 min,27個(gè)循環(huán)(95℃ 變性30 s,55℃ 退火30 s, 72℃ 延伸45 s),最后72℃延伸 10 min (PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。擴(kuò)增體系為20 μL,4 μL 5*FastPfu 緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL 引物(5μmol/L), 0.4 μL FastPfu 聚合酶；10 ng DNA模板。

2.4 Illumina Miseq 測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進(jìn)行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST (Promega, USA) 進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái) (Illumina, San Diego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE250的文庫。

構(gòu)建文庫步驟: (1)連接“Y”字形接頭; (2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段; (3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集; (4)氫氧化鈉變性, 產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

2.5 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控,使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：

(1)設(shè)置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp的序列；

(2)barcode需精確匹配,引物允許2個(gè)堿基的錯(cuò)配,去除模糊堿基；

(3)根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接,overlap需大于10 bp。去除無法拼接的序列。

使用UCHIME軟件剔除嵌合體,得到優(yōu)化序列；根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類。利用mothur軟件對(duì)所有序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣,以抽取到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀疏曲線(Rarefaction curve)；基于OTU進(jìn)行稀釋性曲線分析,并計(jì)算Chao1豐度指數(shù),覆蓋度(Coverage)和Shannon多樣性指數(shù),Shannoneven均勻度指數(shù)；比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)(設(shè)置比對(duì)閾值為70%),利用RDP-classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋,并在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成；利用冗余分析研究土壤化學(xué)指標(biāo)與細(xì)菌群落關(guān)系。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

可知,油松苗地的土壤有機(jī)質(zhì)、全磷、有效磷含量和pH值均低于柴胡地；其中,兩者之間的有機(jī)質(zhì)和全磷含量差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；然而, 油松地土壤的全氮、堿解氮、全鉀和有效鉀含量均大于柴胡地土壤,但之間差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)(表1)。

表1 2種植被下土壤化學(xué)性質(zhì)

不同小寫字母表示在0.05水平下具有差異

3.2 細(xì)菌高通量測(cè)序數(shù)據(jù)特性

圖1 不同土壤樣品細(xì)菌稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil bacteria in different sampled

稀釋曲線(Rarefaction curve)是用來描述隨著樣品量的加大,可能檢測(cè)到的物種種類隨之增加的狀況,是調(diào)查樣品的物種組成和預(yù)測(cè)樣品中物種豐度的有效工具,在生物多樣性調(diào)查中,被廣泛用于判斷樣品量是否充分以及估計(jì)物種豐度?？梢钥闯?土壤的6個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的稀釋曲線均基本趨于平緩,說明取樣比較合理,實(shí)際環(huán)境中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的置信度較高,能夠比較真實(shí)的反映出樣品的細(xì)菌群落(圖1)。

3.3 土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性

各處理組的細(xì)菌的Coverage指數(shù)都大于90%,說明在OTU水平上的測(cè)序結(jié)構(gòu)能夠反映所測(cè)樣本中細(xì)菌的真實(shí)情況。OTUs表示豐土壤微生物豐富度實(shí)際觀測(cè)值,可以看出,油松土壤細(xì)菌的OTUs小于B,但差異均不顯著(P>0.05)。油松土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)小于柴胡,但差異也均不顯著(P>0.05)；油松土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)小于柴胡,但差異也不明顯(P>0.05)。油松土壤細(xì)菌的Shannoneven指數(shù)小于柴胡,差異均達(dá)到顯著水平(P<0.001)(表2)。

表2 2種植被下土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

3.4 群落組成分析

兩種植被下土壤共檢測(cè)出37個(gè)細(xì)菌門和84個(gè)細(xì)菌綱；其中,34個(gè)門為共有細(xì)菌門,占91.9%；79個(gè)綱為共有細(xì)菌綱,占94.0%(圖2)。對(duì)每個(gè)有效序列進(jìn)行門(Phylum)水平上的注釋分類,兩種植被的土壤檢測(cè)出10個(gè)以上細(xì)菌門(相對(duì)豐度大于1%)主要有：變形菌門(Proteobacteria),酸桿菌門(Acidobacteria),綠彎菌門(Chloroflexi),浮霉菌門(Planctomycetes),放線菌門(Actinobacteria),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),擬桿菌門(Bacteroidetes),硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(圖3)。這些鑒定出來的細(xì)菌門,按照豐富度由高到低排列均為(優(yōu)勢(shì)菌在兩個(gè)植被土壤中豐富度高低順序一致)：變形菌門(Proteobacteria)>酸桿菌門(Acidobacteria)>綠彎菌門(Chloroflexi)>浮霉菌門(Planctomycetes)>放線菌門(Actinobacteria)>芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)>擬桿菌門(Bacteroidetes)>硝化螺旋菌門(Nitrospirae)。通過物種差異分析得出,油松地土壤中的變形菌門(Proteobacteria)豐度顯著低于柴胡土壤(P<0.05),綠彎菌門(Chloroflexi)的豐度卻顯著高于柴胡土壤(P<0.05)；而其他細(xì)菌門在兩者之間差異不明顯,未達(dá)到顯著水平(P>0.05)(圖3)。

圖2 門和綱水平下的細(xì)菌物種Venn圖Fig.2 The Venn map of bacterial community at phylum level (Ⅰ) and class leve (Ⅱ)圖注：(門水平下)Proteobacteria 變形菌門,Acidobacteria 酸桿菌門,Chloroflexi綠彎菌門,Planctomycetes浮霉菌門,Actinobacteria 放線菌門,Gemmatimonadetes 芽單胞菌門,Bacteroidetes擬桿菌門,Nitrospirae 硝化螺旋菌門；(綱水平下)Acidobacteria酸桿菌綱,Betaproteobacteria β-變形菌綱,Actinobacteria放線菌綱,Alphaprotebacteria α-變形菌綱,Gemmatimonadetes芽單胞菌綱,Dellaproteobacteria Δ-變形菌綱,Planctomycetocia浮霉菌綱, Anaerolinease厭氧繩菌綱

圖3 門和綱水平下的細(xì)菌群落組成Fig.3 Composition of bacterial community at phylum level and class leve

在綱分類水平上,兩個(gè)植被的土壤優(yōu)勢(shì)菌為：酸桿菌綱(Acidobacteria),β-變形菌綱(β-proteobateria),放線菌綱(Actinobacteria),α-變形菌綱(α-proteobacteria), 芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes),Δ-變形菌綱(Δ- proteobateria),浮霉菌綱(Planctomycetocia), 厭氧繩菌綱(Anaerolineae)。綱水平上的優(yōu)勢(shì)菌豐富度高低順序在兩個(gè)植被土壤不太一致,但均是酸桿菌綱(Acidobacteria)豐富度最高,而β-變形菌綱(β-proteobateria)豐富度次之。同樣,通過物種差異分析得出,各優(yōu)勢(shì)菌的豐度在兩個(gè)植被土壤之間差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

3.5 環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落的影響

相關(guān)性分析表明,變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐富度與堿解氮呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),酸桿菌門(Acidobacteria)相對(duì)豐富度與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),放線菌門(Actinobacteria)相對(duì)豐富度與全氮和堿解氮均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對(duì)豐富度與堿解氮呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),擬桿菌門(Bacteroidetes)相對(duì)豐富度與有效磷呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表3 土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌(門水平下)相對(duì)豐富度與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性

**P<0.01 ,*P<0.05

可知,有機(jī)質(zhì),全氮,全鉀,堿解氮和全磷含量均對(duì)土壤細(xì)菌具有顯著影響；其中,堿解氮和全氮因子對(duì)細(xì)菌的影響最大。RAD分析顯示,第一排序軸解釋了樣本中94.72%的變異,第二排序軸解釋了樣本中3.00%的變異,兩者結(jié)合解釋率達(dá)97.72%(圖4)。

圖4 土壤細(xì)菌與土壤化學(xué)因子的冗余分析 Fig.4 Representative difference analysis (RDA) of the relationships between soil physiochemical properties and bacterial communites under two vegetations

4 討論

通過高通量測(cè)序技術(shù)分析2種人工植被類型下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性。由稀釋曲線可知,本研究采集的土壤樣品合理,其鑒定結(jié)果能夠準(zhǔn)確的反映實(shí)際土壤樣品中細(xì)菌群落；同樣,對(duì)土壤樣品中細(xì)菌測(cè)序得到的文庫覆蓋率(Coverage)均達(dá)到95%以上,表明樣品適合分析細(xì)菌多樣性。雖然本次調(diào)查采集的植被土壤面積有限,但樣品采集仍具有一定代表性,能夠反映該研究區(qū)域2種植被類型的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

4.1 2種植被類型下土壤微生物群落組成

通過新一代高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu),具有快速獲取大量信息的優(yōu)勢(shì),并且將這些信息按照需要進(jìn)行相關(guān)解析。本研究在2個(gè)植被土壤樣品中,細(xì)菌鑒定出變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)等37個(gè)門,其中,變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)均是2種植被土壤中豐富度極高的細(xì)菌群類,變形菌門為豐富度最高優(yōu)勢(shì)菌門,而該區(qū)域土壤呈堿性,這也就證實(shí)了變形菌門(Proteobacteria)為堿性土壤中的主要優(yōu)勢(shì)群落,這與很多[22- 24]研究結(jié)果相似；也有一些研究得出的結(jié)論與之不同[25],可能是由于土壤間的異質(zhì)性造成的。同樣,兩種植被的土壤共檢測(cè)到84個(gè)細(xì)菌綱；其中,豐富度較高的優(yōu)勢(shì)菌主要為酸桿菌綱(Acidobacteria)和β-變形菌綱(β-proteobateria),這與劉洋等[26]研究結(jié)果相似,即這兩種優(yōu)勢(shì)菌均普遍存在土壤中且豐富度最高。這些研究結(jié)果也說明了,盡管植被類型不同,但處于相同生境中的土壤微生物類群具有相似性。

變形菌門(Proteobacteria)是一大類細(xì)菌門類,在很多土壤細(xì)菌群落研究中具有很高的相對(duì)豐度[27- 28],其包含有能與植物共生的固氮細(xì)菌,可以增強(qiáng)土壤的固氮能力,屬于異養(yǎng)型細(xì)菌。有研究表明,土壤變形菌門豐富度的高低可以在一定程度上反映土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分含量的高低。綠彎菌門(Chloroflexi)是一類通過光合作用,以CO2為碳源產(chǎn)生能量的細(xì)菌,因此在有機(jī)質(zhì)含量低的土壤中具有競(jìng)爭(zhēng)力[29]。對(duì)比油松地和柴胡地土壤微生物群落發(fā)現(xiàn),油松地土壤中變形菌門(Proteobacteria)的豐度顯著低于柴胡地土壤,綠彎菌門(Chloroflexi)的豐度顯著高于柴胡地土壤,但酸桿菌門(Acidobacteria)的豐度在兩者間卻無明顯差異。植物生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)(包括植物根系分泌物)進(jìn)入土壤,直接影響土壤微生物的群落組成；由于不同植被生理特性存在差異,產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)種類和數(shù)量不同,導(dǎo)致不同植被下土壤微生物物種出現(xiàn)差異[30]。與柴胡相比,油松苗雖然會(huì)產(chǎn)生較多的枯落物輸入土壤,但其屬于深根樹種,根系發(fā)達(dá)且穿透能力強(qiáng),對(duì)土壤理化性質(zhì)影響比較大,能汲取大量的養(yǎng)分物質(zhì),導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量較柴胡地低；變形菌門(Proteobacteria)在有機(jī)質(zhì)含量較高的柴胡地更適合生存,但綠彎菌門(Chloroflexi)更適合在有機(jī)質(zhì)含量較低的油松林地生存。這可能是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門中的變形菌門和綠彎菌門在兩者之間的存在顯著差異的原因。

酸桿菌綱(Acidobacteria)屬于酸桿菌門類,是一種研究相對(duì)較少的細(xì)菌門類,但普遍以較高豐富度存在土壤中[24]；有研究表明[31],酸桿菌門(Acidobacteria)多出現(xiàn)在陸地且酸性較強(qiáng)的環(huán)境中,而柴胡和油松的土壤均發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌的存在,說明土壤環(huán)境有可能存在酸化的傾向。變形菌門主要包括α-變形菌綱和β-變形菌綱,其包含很多能夠與植物共生的固氮細(xì)菌,可為土壤提供更強(qiáng)的固氮能力。β-變形菌綱能夠利用土壤中有機(jī)物質(zhì)分解產(chǎn)生的氨氣和甲烷[24]；一般變形菌門中,α-變形菌綱豐富度高于β-變形菌綱[26]；也有一些研究表明,β-變形菌綱(β-proteobacteria)的豐富度卻大于α-變形菌綱(α-proteobacteria)[32-33],這與本研究結(jié)果一致。然而,在綱分類水平下的優(yōu)勢(shì)菌的豐度在兩種植被土壤中均無明顯差異。

4.2 2種植被類型下土壤微生物多樣性

采集的土壤中共檢測(cè)到的細(xì)菌有37個(gè)門,84個(gè)綱,168個(gè)目,296個(gè)科和485個(gè)屬,將序列相似性>97%的序列歸為同一OTUS,兩種植被的OTUS分別為2218(油松)和2354(柴胡)。微生物群落多樣性是描述土壤生態(tài)特征的關(guān)鍵指標(biāo),可以通過一系列多樣性指數(shù)來反映,最常用的指標(biāo)有Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Shannoneven指數(shù)。Chao1指數(shù)是用來估計(jì)土壤樣本中物種總數(shù),值越大表示樣品中微生物豐富度越高；Shannon指數(shù)反映土壤微生物多樣性,值越高,群落多樣性越高；Shannoneven指數(shù)表示土壤微生物物種分配的均勻度程度,值越大則說明物種分配均勻程度越高。微生物群落結(jié)構(gòu)和組成多樣性增大有助于增加土壤生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性[34]。細(xì)菌廣泛存在土壤中,也是土壤中個(gè)體數(shù)量最多的有機(jī)體,存在土壤中或者與植物根系共生,能夠參與土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和循環(huán),利于植物生長(zhǎng)發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn),2兩種植被類型的土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)差異均不顯著,只是細(xì)菌的Shannoneven指數(shù)表現(xiàn)為油松地土壤小于柴胡地土壤。這說明,土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性在2種植被下無明顯差異,但油松地土壤細(xì)菌群落的物種分配較柴胡地集中。不同植被對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝及呼吸等生命活動(dòng)會(huì)影響環(huán)境因子,進(jìn)而造成微生物群落多樣性發(fā)生變化[35]。油松較柴胡根系龐大且較深,對(duì)土壤的物理性質(zhì)(結(jié)構(gòu)、孔隙度等)或者養(yǎng)分影響較大,進(jìn)而使得細(xì)菌群落物種分配不均勻。

土壤微生物多樣性可以反映土壤肥力高低。有研究表明,細(xì)菌多樣性高,土壤表現(xiàn)出較高的肥力,而真菌多樣性高,則表現(xiàn)出較低的土壤肥力[36]。從土壤細(xì)菌多樣性的研究結(jié)果來看,兩種植被下土壤細(xì)菌多樣性無明顯區(qū)別,根據(jù)前人研究結(jié)果,可以初步認(rèn)定兩種植被土壤肥力無差異；然而,本研究同時(shí)表明,油松苗地土壤有機(jī)質(zhì)含量和全磷含量卻明顯低于柴胡地土壤,這可能跟兩種土壤真菌群落多樣性差異有關(guān),這需進(jìn)一步分析兩種植被土壤真菌群落多樣性來證實(shí)。

4.3 土壤養(yǎng)分對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

研究表明,土壤養(yǎng)分含量能夠影響土壤微生物種群數(shù)量及分布,而不同植被的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝等生命活動(dòng)不同,導(dǎo)致土壤養(yǎng)分具有差異[37]。在細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)門中,變形菌門(Proteobacteria)與堿解氮顯著負(fù)相關(guān),酸桿菌門(Acidobacteria)與全氮顯著負(fù)相關(guān)；通過RAD綜合分析得出,有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀、堿解氮和全磷均對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響,其中,群落受堿解氮和全氮影響較大,且環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌的解釋率為97.72%。本研究也表明,油松地土壤的有機(jī)質(zhì)含量和有效磷含量均顯著低于柴胡地,其他養(yǎng)分含量無顯著差異,這就說明了2種植被下土壤由于堿解氮和全氮含量無明顯差異,因而未導(dǎo)致細(xì)菌群落多樣性出現(xiàn)差異。然而,長(zhǎng)期種植油松苗將會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分處在較低水平,因此在大苗培育期要因土施肥,提高土壤肥力,尤其需要及時(shí)補(bǔ)充土壤有機(jī)質(zhì),這樣既可以增加土壤養(yǎng)分又可提高細(xì)菌豐度和多樣性。

5 結(jié)論

綜上可知,通過高通量測(cè)序技術(shù)分析2種不同土地利用方式下山麓耕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性,得出以下結(jié)論：(1)油松地和柴胡地的土壤細(xì)菌豐度和多樣性無明顯差異,但油松地土壤細(xì)菌群落的物種分配較柴胡地集中。(2)兩種植被土壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)；主要的優(yōu)勢(shì)菌綱為酸桿菌綱(Acidobacteria),β-變形菌綱(β-proteobacteria),放線菌綱(Actinobacteria)；且僅有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門中的變形菌門和綠彎菌門在兩者之間的差異顯著,即油松地土壤中的變形菌門(Proteobacteria)的豐富度顯著低于柴胡地土壤,綠彎菌門(Chloroflexi)豐富度卻顯著高于柴胡地。(3)變形菌門(Proteobacteria)與土壤的堿解氮含量呈顯著負(fù)相關(guān),酸桿菌門(Acidobacteria)與全氮顯著負(fù)相關(guān)；總體來看,堿解氮和全氮對(duì)土壤細(xì)菌群落影響較大,被環(huán)境因子解釋率均達(dá)到97%以上,是影響細(xì)菌群落的最主要的土壤因子。長(zhǎng)期種植油松苗將會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分處在較低水平,因此,在大苗培育期中要因土施肥,提高土壤肥力,尤其需要及時(shí)補(bǔ)充土壤有機(jī)質(zhì),這樣既可以增加土壤養(yǎng)分又可提高細(xì)菌豐度和多樣性。本研究結(jié)果可為認(rèn)識(shí)小隴山不同植被土壤微生物群落組成及多樣性提供理論,同時(shí),也為當(dāng)?shù)剡M(jìn)行人工油松苗的種植、經(jīng)營(yíng)及土壤管理提供科學(xué)參考。