陳亦華，程振宇，邵林華，何忠平，王瑞權(quán)，傅斌

（1.金華市人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 金華 321000；2.金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 藥理科，浙江金華 321000；3.金華市人民醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321000）

顱腦損傷是一種常見的外傷形式，藥物是其治療的重要手段之一[1-3]。醒腦靜注射液由麝香、郁金、冰片和梔子等中藥材提制而成，具有醒腦開竅和活血化瘀的作用[4-6]?？纱┩秆X屏障，顯著降低體溫和消除腦水腫，從而改善腦出血、腦梗死和顱腦損傷患者意識狀態(tài)和神經(jīng)功能，降低病死率和致殘率[7-9]。目前，少有研究揭示醒腦靜注射液對腦損傷后認(rèn)知功能的影響。本研究使用醒腦靜注射液腹腔注射治療大鼠顱腦損傷，觀察其對大鼠認(rèn)知功能和外傷腦組織細(xì)胞凋亡的影響，探討醒腦靜注射液對顱腦損傷大鼠認(rèn)知功能的改善作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康SD大鼠，雄性，清潔級，體質(zhì)量300～350 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002；醒腦靜注射液（規(guī)格：10 mL/支，1610012）購自大理藥業(yè)股份有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（1783900）購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2235型）購自上海萊卡公司；生物倒置顯微鏡（BX43型）購自日本奧林巴斯公司；腦立體定位儀（DW-2000型）購自成都泰盟科技有限公司；柔性顱骨鉆（ZH-RX2型）購自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分組：將108只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、外傷組和治療組，每組36只。3組大鼠均按照劑量50 mg/kg予以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。外傷組和治療組大鼠采用Feeney自由落體損傷裝置制作大鼠腦外傷動物模型，擊錘重量為40 g，墜落高度為25 cm，打擊深度為5 mm。假手術(shù)組大鼠不做外力打擊，切開頭皮及鉆孔后縫合頭皮。假手術(shù)組和外傷組大鼠操作完成后每日均予1 mL 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，治療組大鼠操作完成后每日按5 mL/kg劑量予以腹腔注射醒腦靜注射液，連續(xù)7 d。依次在造模后12、24、48、72和168 h后，取每組6只大鼠以80 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離外傷灶周邊腦組織作指標(biāo)檢測。取每組6只大鼠用于認(rèn)知功能評價。

1.2.2 指標(biāo)檢測：采用TUNEL法檢測大鼠外傷腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕紅色定義為細(xì)胞染色陽性，在顯微鏡下計算10個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，總計1 000個細(xì)胞，計算平均陽性率（%）。采用Western blot檢測大鼠外傷腦組織procaspase-3蛋白表達(dá)，以β-actin水平為內(nèi)對照，比較相對灰度值。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測外傷腦組織caspase-3蛋白表達(dá)，caspase-3蛋白主要定位于胞漿，染色強(qiáng)度計為0（無色）、1（淡黃色）、2（棕黃色）、3（棕黑色），陽性染色細(xì)胞百分比計為1（0～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）、4（76%～100%）。Caspase-3蛋白染色的最終評分由染色強(qiáng)度和陽性染色細(xì)胞百分比相乘獲得，即免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)。

1.2.3 認(rèn)知功能測定：根據(jù)VORHEES等[10]的方法，于外傷后8 d開始進(jìn)行歷時5 d的水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，評價大鼠的學(xué)習(xí)能力。大鼠逃避潛伏期定義為從大鼠入水到找到水下隱蔽平臺并立于其上所需時間，記錄時間為120 s。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析比較單個時間點(diǎn)3組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例、procaspase-3及caspase-3蛋白表達(dá)和大鼠逃避潛伏期，采用重復(fù)測量方差分析比較5個時間點(diǎn)3組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例、procaspase-3及caspase-3蛋白表達(dá)和大鼠逃避潛伏期，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷后腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 在各個時間點(diǎn)，3組大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=220.116，P＜0.01），組間兩兩比較，外傷組大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05）；在72 h和168 h，治療組大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞比例較外傷組顯著下降（P＜0.05），見圖1-2。

圖1 醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷后72 h腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL，×200）

圖2 醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷后腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

2.2 醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷后腦組織procaspase-3蛋白表達(dá)的影響 在各個時間點(diǎn)，3組大鼠腦組織procaspase-3蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=275.114，P＜0.01），組間兩兩比較，外傷組大鼠腦組織procaspase-3蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05）；在72 h和168 h，治療組大鼠腦組織procaspase-3蛋白表達(dá)量較外傷組顯著下降（P＜0.05），見圖3。

圖3 醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷后腦組織procaspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.3 醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷后腦組織caspase-3蛋白表達(dá)的影響 在各個時間點(diǎn)，3組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=147.650，P＜0.01），組間兩兩比較，外傷組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05）；在72 h和168 h，治療組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)量較外傷組顯著下降（P＜0.05），見圖4-5。

圖4 醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷后72 h腦組織caspase-3蛋白表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)染色，×200）

圖5 醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷后腦組織caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.4 醒腦靜注射液對顱腦損傷大鼠認(rèn)知功能的影響 在外傷后各時間點(diǎn)，3組大鼠逃避潛伏期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=153.803，P＜0.01），組間兩兩比較，外傷組大鼠逃避潛伏期均顯著長于假手術(shù)組（P＜0.01），治療組大鼠逃避潛伏期均顯著短于外傷組（P＜0.01），見表1。

3 討論

顱腦創(chuàng)傷是外力作用造成的腦損傷形式。外力不僅直接作用于腦組織，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，還引起一系列的繼發(fā)性腦損傷，進(jìn)而對神經(jīng)組織造成損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙，從而造成認(rèn)知功能損傷[11-13]。繼發(fā)性腦損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及細(xì)胞缺血缺氧、炎癥反應(yīng)、氨基酸毒性作用、氧化自由基反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等諸多機(jī)制。細(xì)胞凋亡作為一種程序化的細(xì)胞死亡方式，是腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式之一[14-16]。Caspase-3介導(dǎo)的信號通路參與顱腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程。Procaspase-3是一種無活性的蛋白酶原，顱腦損傷后，其在多種蛋白水解酶的催化作用下分解為caspase-3。Caspase-3可使細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白及細(xì)胞修復(fù)酶裂解，并激活DNA酶使DNA斷裂導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，procaspase-3和caspase-3蛋白在顱腦損傷后表達(dá)增加，且在外傷后24 h到達(dá)高峰期，與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程同步。本研究也發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組顯著延長。這些數(shù)據(jù)說明，caspase-3信號通路介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡參與了顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷過程，也可能是大鼠認(rèn)知功能損害的重要機(jī)制之一。

表1 醒腦靜注射液對顱腦損傷大鼠逃避潛伏期的影響（每組6只，，s）

表1 醒腦靜注射液對顱腦損傷大鼠逃避潛伏期的影響（每組6只，，s）

與外傷組比：aP＜0.05

組別 第8天 第9天 第10天 第11天 第12天假手術(shù)組 60.8±2.8a 52.2±4.0a 41.5±2.7a 34.0±3.1a 31.5±2.8a外傷組 111.7±2.0 94.8±4.1 86.5±4.2 77.8±3.9 59.5±3.4治療組 101.5±4.3a 81.3±3.4a 72.0±3.8a 63.8±5.2a 43.2±4.0a F 71.742 32.548 40.137 28.998 16.672 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

近幾年，中藥成為顱腦損傷治療的重要組成部分，且不良反應(yīng)少，安全有效。中藥制劑用于疾病治療往往需要一定的療程。檢索醒腦靜注射液用于動物實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，該中藥制劑的使用時間和劑量均跨度較大，使用時間為1～7 d，使用劑量為1～20 mL/kg；而使用方式包括靜脈注射和腹腔注射[20-22]。為了保證療效，同時減少不良反應(yīng)，本研究使用每日5 mL/kg醒腦靜注射液腹腔注射治療顱腦損傷大鼠，使用時間為7 d。

醒腦靜注射液具有促醒和開竅作用，臨床用于腦損傷治療效果顯著，可明顯改善腦損傷患者神經(jīng)功能[20-22]。目前，少有研究揭示醒腦靜注射液對顱腦損傷后認(rèn)知功能的影響。本研究在顱腦損傷后第8天，也就是在藥物治療結(jié)束后第2天開始進(jìn)行歷時5 d的水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，評價大鼠的學(xué)習(xí)能力。通過對大鼠逃避潛伏期進(jìn)行分析和比較發(fā)現(xiàn)，醒腦靜注射液腹腔注射可顯著提高顱腦損傷損傷大鼠的認(rèn)知功能。

醒腦靜注射液用于腦損傷治療的有效性已逐漸在臨床上顯現(xiàn)，但具體的作用機(jī)制仍不清楚。有研究表明醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減輕顱腦損傷后腦水腫及抑制氧自由基反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)[20]。另有研究顯示，醒腦靜注射液也可能通過下調(diào)血腫周圍腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9和補(bǔ)體C3表達(dá)水平而達(dá)到保護(hù)血-腦屏障、減輕血管源性腦水腫，進(jìn)而保護(hù)腦功能[21]。細(xì)胞凋亡相關(guān)的研究顯示，醒腦靜注射液可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制顱腦損傷后的大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡[22]。

本研究結(jié)果顯示，醒腦靜注射液用于治療大鼠顱腦損傷可顯著降低顱腦損傷大鼠外傷腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時也顯著抑制procaspase-3和caspase-3蛋白的表達(dá)。這些研究數(shù)據(jù)說明，抑制caspase-3介導(dǎo)的信號通路可能是醒腦靜注射液抗顱腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，而抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡也可能是醒腦靜注射液改善顱腦損傷大鼠認(rèn)知功能的重要途徑之一。

利益沖突申明 本研究無任何利益沖突