孫夢(mèng)燏，呂文娟，趙新顏，秦莉莉，胡春紅*

(1.天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天津 300070；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心，北京 100050)

膽道閉鎖(biliary atresia, BA)是一種伴有進(jìn)行性肝纖維化和肝內(nèi)外膽管淤積的膽管炎性疾病，常發(fā)生于出生后3個(gè)月內(nèi)嬰兒，病情嚴(yán)重時(shí)可迅速進(jìn)展為膽汁性肝硬化(biliary cirrhosis, BC)，導(dǎo)致患兒死亡。早期診斷對(duì)BA后續(xù)治療具有重要意義，越早進(jìn)行膽汁引流，術(shù)后效果越好，同時(shí)也越有利于進(jìn)行肝移植手術(shù)[1]。在BA發(fā)病早期，小葉間膽管顯著增生；隨著病情發(fā)展，逐漸出現(xiàn)小動(dòng)脈增生，并伴有動(dòng)脈壁增厚，膠原大量增生，纖維化形成，最終原有膽管消失[2]。因此，分析脈管變化對(duì)診斷BA十分重要。目前研究BA的脈管結(jié)構(gòu)變化通?；诟闻K組織切片，但該技術(shù)取樣面積小，存在取樣誤差，需多次取樣，且對(duì)脈管僅限于在2D層面進(jìn)行觀察[3]；傳統(tǒng)X線、超聲、CT等臨床常用的影像學(xué)檢查技術(shù)則因存在空間和襯度分辨率較低的局限性，無(wú)法反映肝組織內(nèi)的細(xì)微病理變化。X線相襯CT(phase-contrast computed tomography, PCCT)通過(guò)X線透過(guò)樣品的相位移動(dòng)信息進(jìn)行成像，與傳統(tǒng)X線吸收CT成像相比，可實(shí)現(xiàn)對(duì)軟組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的清晰顯像，并能夠與3D可視化技術(shù)結(jié)合，獲得高分辨率的軟組織內(nèi)部3D結(jié)構(gòu)圖像。隨著近年來(lái)的發(fā)展，該技術(shù)已應(yīng)用于多種疾病的顯微結(jié)構(gòu)分析研究[4-8]。本研究采用PCCT對(duì)離體BA組織進(jìn)行成像，分析BA的脈管顯微結(jié)構(gòu)變化。

1 材料與方法

1.1樣品制備 4份人體BA樣品(1～4號(hào)樣品)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院肝病研究中心提供，本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)并在征得患兒家屬同意后取材。4例BA患兒均接受肝移植手術(shù)，其中男3例，女1例，分別為8、4、5和12月齡；術(shù)后離體BA樣品以磷酸緩沖液沖洗后，置于4%中性甲醛溶液中固定保存。PCCT掃描前，將樣品切成厚 5 mm、寬約6 mm的塊狀組織；考慮到成像時(shí)間較長(zhǎng)，如樣品處于浸潤(rùn)狀態(tài)，則組織內(nèi)水分蒸發(fā)可引起組織變形，產(chǎn)生大量運(yùn)動(dòng)偽影，并對(duì)后續(xù)圖像校軸產(chǎn)生嚴(yán)重影響，難以實(shí)現(xiàn)微小脈管的準(zhǔn)確成像，本研究對(duì)BA樣品進(jìn)行梯度脫水，乙醇濃度分別為50%、70%、80%、95%、95%、100%和100%，每次間隔2 h，使其充分干燥，以此消除樣品變形對(duì)成像效果的影響。

1.2PCCT成像 采用上海同步輻射光源BL13W1線站進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)，成像裝置由2塊平行擺放的單色晶體、旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)和探測(cè)器組成，見圖1。探測(cè)器分辨力為3.25 μm，X線能量設(shè)為16 keV，探測(cè)器距離樣品25 cm，曝光時(shí)間0.5 s。PCCT掃描時(shí)，將裝有人體BA樣品的錐形管固定于樣品臺(tái)并旋轉(zhuǎn)180°，拍攝 1 080張投影圖，每間隔120張掃描2張背景圖，共采集20張背景圖，而后關(guān)閉光源，采集10張暗場(chǎng)圖。

圖1 PCCT成像裝置示意圖

1.3圖像處理 首先利用背景圖和暗場(chǎng)圖對(duì)PCCT投影圖進(jìn)行校正，并以相位恢復(fù)方法對(duì)校正后圖像進(jìn)行去噪處理和相位信息提取；而后采用濾波反投影算法重建，將重建獲得的圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入Amira 6.3 (FEI, Thermo Fisher Scientific, Bordeaux, France)軟件分別進(jìn)行體繪制，實(shí)現(xiàn)人體BA樣品整體3D重建。同時(shí)，利用閾值分割和區(qū)域生長(zhǎng)算法實(shí)現(xiàn)對(duì)肝動(dòng)脈、膽管及增生膽管、門靜脈等脈管的區(qū)分。

1.4組織病理學(xué)檢查 完成PCCT成像實(shí)驗(yàn)后3個(gè)月內(nèi)，對(duì)樣品進(jìn)行常規(guī)脫水和石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，經(jīng)平滑肌細(xì)胞抗體(smooth muscle cell antibody， SMA)、細(xì)胞角蛋白19抗體(cytokeratin 19， CK19)免疫組化染色及苦味酸天狼星紅染色后，于光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1PCCT投影圖 人體BA樣品PCCT投影圖見圖2。在不使用對(duì)比劑的條件下，PCCT投影圖可清晰顯示直徑為20 μm的微脈管，匯管區(qū)內(nèi)可見多條脈管伴行，但大小脈管交疊，難以區(qū)分脈管類型。

圖2 人體BA樣品PCCT投影圖 1、2號(hào)樣品(A、B)肝實(shí)質(zhì)中存在大量粗糙的顆粒狀結(jié)構(gòu)，1～4號(hào)樣品(A～D)中匯管區(qū)均可見明顯的脈管伴行 (紅箭示脈管伴行，黃箭示顆粒狀結(jié)構(gòu))

2.2CT重建圖像與病理圖對(duì)照 人體BA樣品濾波反投影算法重建圖像及相應(yīng)的病理圖見圖3。PCCT投影圖經(jīng)濾波反投影算法重建后，可清晰顯示匯管區(qū)周圍密集的增生脈管的腔狀結(jié)構(gòu)。人體BA樣品中，動(dòng)脈形態(tài)未見明顯異常，呈現(xiàn)圓形或橢圓形；膽管管腔輪廓存在明顯起伏呈現(xiàn)波浪狀；門靜脈血管破裂，內(nèi)壁組織如絮狀分布，難以觀察到其管腔結(jié)構(gòu)。對(duì)比CT重建圖像及相應(yīng)的SMA、CK19免疫組化染色及苦味酸天狼星紅染色病理圖，可見PCCT圖像所示匯管區(qū)脈管結(jié)構(gòu)與病理圖所見相符。

2.3微脈管3D重建圖像 通過(guò)對(duì)CT重建圖像進(jìn)行體繪制，獲得人體BA樣品匯管區(qū)脈管3D結(jié)構(gòu)(圖4A、4B)，其中可見明顯大脈管伴行，匯管區(qū)周圍存在大量細(xì)小的新生脈管，并成環(huán)狀連接。選取420×830×240像素長(zhǎng)方體區(qū)域(圖4A)對(duì)不同脈管類型進(jìn)行區(qū)分后，分別獲得肝動(dòng)脈(紅色脈管，圖4C)、膽管及增生膽管(綠色脈管，圖4D)、門靜脈(黃色脈管，圖4E)的3D結(jié)構(gòu)，可見膽管增生并連接成環(huán)(圖4D)，包繞匯管區(qū)內(nèi)血管束形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，門靜脈因管壁發(fā)生破裂且受其他脈管擠壓而結(jié)構(gòu)異常(圖4E)。對(duì)照相應(yīng)病理圖，發(fā)現(xiàn)3D重建圖像所示血管及膽管結(jié)構(gòu)與組織病理學(xué)所見相符。

3 討論

BA是新生兒肝內(nèi)外膽道系統(tǒng)閉塞引起的最嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病之一，其主要組織學(xué)特征包括小膽管增生、膽管淤積和匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而多核巨細(xì)胞樣變、肝實(shí)質(zhì)局灶性壞死和髓外造血等表征較少見[2]。膽管增生被認(rèn)為是鑒別BA與其他膽汁淤積癥的高特異性及高敏感性的指標(biāo)[9]。本研究通過(guò)PCCT技術(shù)對(duì)離體BA組織進(jìn)行成像，同時(shí)結(jié)合3D可視化技術(shù)觀察離體BA組織內(nèi)微脈管的3D結(jié)構(gòu)，并基于脈管的3D結(jié)構(gòu)特征對(duì)人體BA樣品中肝動(dòng)脈、膽管及增生脈管、門靜脈進(jìn)行區(qū)分；所得結(jié)果均與組織病理學(xué)檢查相符，提示PCCT可用于肝臟內(nèi)不同類型脈管的成像；但由于PCCT成像角度與病理切片包埋角度難以完全相同，CT圖像與組織病理學(xué)檢查往往存在些許差別。

圖3 人體BA樣品PCCT濾波反投影算法重建圖像及相應(yīng)病理圖 A～C.分別為第421層(A)、455層(B)及550層(C)重建圖像； D.圖A對(duì)應(yīng)的SMA染色病理圖(×40)； E.圖B對(duì)應(yīng)的CK19染色病理圖(×40)； F.圖C對(duì)應(yīng)的苦味酸天狼星紅染色病理圖(×40) (紅箭示動(dòng)脈血管；綠箭示膽管；黑箭示纖維組織)

圖4 人體BA樣品3D重建圖像 A.匯管區(qū)體繪制重建圖像； B.脈管分割整體圖像； C～E.分別為肝動(dòng)脈(C)、膽管及增生膽管(D)、門靜脈(E)3D重建圖像 (白箭示增生膽管的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；紅箭示門靜脈形態(tài)異常)

有關(guān)BA組織的影像學(xué)特征研究通?；诔暀z查，但因聲像圖空間分辨率較低，超聲醫(yī)師主要依靠膽囊形態(tài)對(duì)BA進(jìn)行診斷，難以實(shí)現(xiàn)早期診斷，還可能出現(xiàn)誤診為乳肝的情況[10]。目前傳統(tǒng)X線、CT、超聲等臨床常用的影像學(xué)技術(shù)尚無(wú)法對(duì)<200 μm的微觀結(jié)構(gòu)成像。PCCT不同于傳統(tǒng)CT成像技術(shù)，系根據(jù)X線穿透樣品時(shí)的相位改變信息進(jìn)行成像，相位襯度變化約為吸收襯度變化的1 000倍，在生物軟組織成像方面具有優(yōu)勢(shì)[11]。近年來(lái)，PCCT技術(shù)已廣泛應(yīng)用于研究各種軟組織的影像學(xué)特征。Xuan等[5]應(yīng)用PCCT技術(shù)對(duì)大鼠肝纖維化組織進(jìn)行成像，重建后獲得3D微觀結(jié)構(gòu)；通過(guò)與病理切片對(duì)照，證實(shí)PCCT技術(shù)診斷大鼠肝纖維化具有較高的敏感度、特異度及準(zhǔn)確率。本研究發(fā)現(xiàn)，利用PCCT可對(duì)直徑僅為20 μm的微脈管清晰成像；對(duì)比觀察PCCT圖像與相應(yīng)病理圖，發(fā)現(xiàn)濾波反投影算法重建圖像中門靜脈血管壁破裂，內(nèi)壁成絮狀分布或堆疊在一起，原有膽管輪廓出現(xiàn)褶皺(圖3B、3E)；3D重建結(jié)構(gòu)中也發(fā)現(xiàn)膽管表面出現(xiàn)褶皺，新生膽管連接具有明顯的成環(huán)趨勢(shì)，在門靜脈、肝動(dòng)脈和原有的伴行膽管外周連接成網(wǎng)并與之伴行延伸(圖4D)。

本實(shí)驗(yàn)屬基礎(chǔ)研究，仍存在一些缺陷：①采用離體樣品進(jìn)行PCCT成像，需對(duì)人體BA樣品進(jìn)行沖洗和干燥，難免導(dǎo)致脈管變形；②樣品量較少，未對(duì)微脈管進(jìn)行定量分析。此外，與臨床常用的傳統(tǒng)X線、CT、超聲等成像技術(shù)相比，PCCT成像視野較小，僅為6 mm×5 mm，且對(duì)光源的單色性要求較高，這在一定程度上限制了其推廣應(yīng)用，但目前基于常規(guī)X線管的PCCT大視野成像研究已取得一定進(jìn)展[12-14]。

綜上所述，通過(guò)PCCT及其圖像后處理技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)人體BA樣品中微脈管的成像，并可清晰顯示離體BA組織中肝動(dòng)脈、膽管及增生膽管、門靜脈的2D和3D結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)對(duì)不同脈管進(jìn)行區(qū)分。