張振建，朱文碧，孫溪,李思佳，田耕耘，郭軍康

摘要：通過前期實驗篩選出合適的植物根際促生菌，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)制成菌液，用來研究它對油麥菜、莧菜的生長是否具有促進(jìn)作用。本文描述在室外將植物種子用菌液處理后播種在穴盤中，待發(fā)育成幼苗移栽至花盆內(nèi)。研究不同植物根際促生菌以及不同的接種方式對促進(jìn)油麥菜和莧菜的生長是否有效。研究結(jié)果表明：菌液及培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)對種子發(fā)芽率有促進(jìn)作用；葉面積大的植株在使用植物根際促生菌的時候更適合采用噴葉的接種方式，而葉片面積小的植株更適合灌根的接種方式；菌液復(fù)配時效果要顯著好于單一菌液；同時，植物根際促生菌的適應(yīng)能力還待加強(qiáng)，只有其成功定植在植株根部才能發(fā)揮作用。此研究為以后研發(fā)更合適的微生物肥料提供物質(zhì)和理論依據(jù)，對于使用微生物肥料進(jìn)行實踐生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：植物根際促生菌；生物量；油麥菜；莧菜

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目：根際植物促生菌誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)抗性調(diào)控鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理研究（41473115，2015.01-2018.12，95萬元）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201610061062，2016.05-2017.05，1萬元）

中圖分類號： S543 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.20.031

中國是人口大國，同樣也是糧食消費(fèi)大國。化肥的普遍使用，保障了我國糧食的基本需求。然而，我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)高投入高產(chǎn)出的發(fā)展模式，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)嚴(yán)重依賴化學(xué)肥料，隨著化肥使用量的增加，其利用率卻逐年降低[1]，不僅造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本增加，而且容易造成土壤質(zhì)量下降，未被利用的氮、磷、鉀等養(yǎng)分隨降雨進(jìn)入到地下水與江河等生態(tài)環(huán)境中，導(dǎo)致江河水體富營養(yǎng)化，引起區(qū)域生態(tài)失衡與環(huán)境污染，對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成威脅。以植物根際促生菌為主要成分的微生物肥料具有綠色無毒，環(huán)境友好，肥效均衡，利于作物穩(wěn)定生長等特點(diǎn)。在保持土壤肥力、提高營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化、促進(jìn)作物生長、抑制土傳病害、穩(wěn)定生態(tài)平衡等方面起著重要作用[2]，被人們看作是化肥的最好替代品。通過添加作物生長有益微生物有利于改變過量施肥造成土壤菌群結(jié)構(gòu)單一化趨勢。植物根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria ，PGPR）是指生存于植物根際、根表，可以通過直接或間接的方式促進(jìn)植物的生長[3-5]，其主要機(jī)理是通過菌體：產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長的信號物質(zhì)，如吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯[6-7]；非共生固氮[8]；產(chǎn)嗜鐵素[9]、抗生素[10]和氰化物[11]抵抗病原菌；溶解磷礦物及其他養(yǎng)分[12-14]。根據(jù)PGPR定殖于根際的位置，又可將其劃分為2類：一類是胞內(nèi)PGPR（intracellular PGPR， iPGPR），其特征是通常只局限性地定殖于植物某些特殊組織或細(xì)胞內(nèi)，可形成根瘤；另一類是胞外PGPR（extracellular PGPR，ePGPR），其特征是定殖于根系細(xì)胞外，不形成根瘤，但能依靠產(chǎn)生信號物質(zhì)直接促進(jìn)植物生長，或者提高植物抗性或加速土壤元素循環(huán)等[15]。

隨著人們生活水平的提高，蔬菜消費(fèi)在膳食結(jié)構(gòu)中占比逐年增加。然而根際植物促生菌對蔬菜作物生長相關(guān)研究較少。本研究通過接種根際植物促生菌，觀察其對蔬菜發(fā)芽及生物量的影響，為減少農(nóng)田化肥農(nóng)藥使用量并加速作物生長，改善設(shè)施蔬菜綠色生產(chǎn)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試“四季油麥菜”種子由唐山市路南荷花坑種子繁育站生產(chǎn)；“一點(diǎn)紅莧菜”種子由青縣鈺禾蔬菜育種中心生產(chǎn)。

供試菌種為PN133（烏拉爾桿菌）和Y42（土壤根瘤桿菌），均由農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所的郭軍康博士提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體的培養(yǎng)及處理 將PN133與Y42按1∶100接種至LB液體培養(yǎng)基，28℃震蕩培養(yǎng)3d，10000r/min離心3min收集菌體，保存Y42培養(yǎng)基，菌體以超純水洗2次，懸浮于同體積超純水中，待用。

1.2.2 種子的處理 新種拆包后測定其發(fā)芽率，確定其發(fā)芽率與包裝相符。200粒/組分開，分為6組，分別是CK組、Y組、P組、P+Y組、Y10X組、Y100X組。等量種子表面消毒后置于各處理中浸種，其中CK組是超純水對照組；Y組是Y42完全菌液；P組為PN133完全菌液；P+Y組是PN133和Y42兩種菌液1∶1混合后的菌液；Y10X組是用離心后的Y42培養(yǎng)基稀釋10倍后制得的培養(yǎng)基溶液；Y100X組是用離心后的Y42培養(yǎng)基稀釋100倍后制得的培養(yǎng)基溶液。浸種時間為2小時。浸種完成后取每組3×50粒種子用于測定各處理對種子發(fā)芽率的影響。將50粒種子整齊的擺放在滅菌后的培養(yǎng)皿（帶濾紙）中，加入3ml無菌水，放在暗通風(fēng)培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)3天，每天對培養(yǎng)皿進(jìn)行補(bǔ)水，保持濾紙濕潤。另一部分種子按分組種在穴盤中，待其發(fā)育成幼苗，選擇品質(zhì)優(yōu)良的幼苗進(jìn)行移栽。

1.2.3 幼苗的處理 穴盤中幼苗長成后，取每盆0.8kg充分干燥的營養(yǎng)土，篩選品質(zhì)優(yōu)良的幼苗進(jìn)行移栽，每盆按等邊三角形栽入3株幼苗。移栽完成后，先不進(jìn)行澆水，觀察1日，待每株幼苗情況穩(wěn)定后，再進(jìn)行澆水。一周后，開始向Y組、P組、P+Y組的植株進(jìn)行灌根處理，每盆按照3×5mL注入菌液；Y10X組和Y100X組進(jìn)行噴葉處理，要求葉片正反面均被潤濕，每周處理一次。

1.3 項目測定

在每周進(jìn)行處理前，對每盆中各植株的最長葉長、葉寬和每株的葉片數(shù)進(jìn)行記錄，處理2次后準(zhǔn)備收樣，用電子天平稱量植株的地上部分鮮重和地下部分鮮重。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，獲得平均值。對不同處理之間的差異進(jìn)行單因素的方差分析和多重比較（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對種子發(fā)芽率的影響

由圖1和圖2可見，在恒溫恒濕條件下，兩種植物根際促生菌均對種子的萌發(fā)有很大的促進(jìn)作用，并且在加入一定濃度的LB培養(yǎng)基后，種子的發(fā)芽率接近100%。

2.2 不同處理對植物生長的影響

2.2.1 莧菜的生長狀況

莧菜的幼苗6月3日從穴盤移栽入盆中，穩(wěn)定一周后開始向各組中加入變量，第一次處理過后，各組差異不大，莧菜生長速度緩慢；第二次處理過后，各組差異較大：灌根P、Y混合菌液的P+Y組比其他幾組植株長勢好，達(dá)到了0.05的顯著水平，最明顯的差異是相比于其他處理，本組植株高、葉片大、葉色更濃綠健壯、根莖發(fā)達(dá)，相比于對照組，葉面積、葉片數(shù)要大很多；但單獨(dú)灌根P菌或Y菌對促進(jìn)莧菜的生長效果并不明顯，植株生長狀況只是比對照組好一些。灌根和噴葉這兩種處理方式對莧菜的生長影響差異不大。在莧菜收樣前統(tǒng)計了各處理植株的平均葉長、葉寬和有效葉片數(shù)，綜合計算了各處理的生長情況，從圖4可以看出，P+Y組的莧菜生長狀況最好，但噴葉處理的Y100X組生長水平要低于CK組，說明低濃度的培養(yǎng)基對莧菜的生長沒有幫助。

2.2.2 油麥菜的生長狀況

油麥菜的幼苗是在6月3日從穴盤移栽入盆中，穩(wěn)定一周后開始向各組中加入變量，第一次處理后，各組植株生長狀況差異不大，植株均長勢良好；第二次處理過后，各組開始出現(xiàn)差異：灌根P、Y混合菌液的P+Y組和噴葉處理的Y10X組、Y100X組植株的葉片增長速度明顯高于其他3組；為了驗證根際促生菌的作用時效，在6月25日向各組中加入了等量的蒸餾水，10天后，繼續(xù)測量植株的各項數(shù)值，發(fā)現(xiàn)各組植株的生長速率較加入菌液時大幅下降，只有CK組和Y10X組Y100X組植株葉片有小幅增長，分析原因可能是植株進(jìn)行灌根時，使植物對細(xì)菌產(chǎn)生了依賴，一旦植株失去了這種外源幫助，其生長速率可能比正常植株還要低。但由于油麥菜的葉面積較大，進(jìn)行噴葉處理時，葉面上存留的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)較多，所以在一段時間內(nèi)不添加新的外源菌同樣能依靠培養(yǎng)基殘留物質(zhì)培育新菌來幫助其生長。通過最后統(tǒng)計各處理植株的平均葉長、葉寬和有效葉片數(shù)，綜合計算出各處理的生長狀況，見圖6。從圖中可看出，采用噴葉方式處理的Y10X組和Y100X組生長狀況最好，其次是灌根處理的P+Y組，最差的是灌根處理的P組，可能P組對油麥菜的生長無太大的促進(jìn)作用。油麥菜這種葉片較長而窄的植株，相比于莧菜那種圓形的葉片，更適合用噴葉的方式進(jìn)行處理。

2.3 不同處理對莧菜收獲生物量的影響

圖7和圖8是莧菜在第二次處理后一周稱量的數(shù)據(jù)。從數(shù)據(jù)和實物圖中可明顯觀察到，P+Y組的莧菜生長狀況最好，其他各處理生長狀況差異不大，噴葉處理的Y10X組和Y100X組在最后的生物量統(tǒng)計上不如CK組，說明噴葉處理對莧菜的生長可能作用不大。

3 結(jié)論

從上述兩種葉菜生長狀況來看，只有同時接種不同種PGPR，植株的生長進(jìn)度才會顯著提高，分析原因可能是兩種PGPR對植株的功能不同。任何單一菌種只能提高植株的固氮作用或解磷解鉀能力[16]。而復(fù)配施肥則可使上述功能全部作用于植株上，大大提高其肥效。

觀察油麥菜后期生長速率明顯下降，分析其原因可能是實驗后期，PGPR在植物根系的定植關(guān)系破裂。影響微生物在植物根部定植的主要因素：一類是生物學(xué)因素， 包括微生物自身特性、接種數(shù)量、植物根系分泌物等；另一類是非生物學(xué)因素，包括土壤類型、土壤含水量和Ca2+等土壤理化性狀[17]。實驗期間偶遇一場特大暴雨，使油麥菜盆底部24h內(nèi)始終浸泡在水中，土壤含水量驟升，導(dǎo)致前期的定植關(guān)系被破壞。所以在今后的實驗中可以用天然抗生素抗性標(biāo)記法實時檢測PGPR的定植情況[18]。

考慮到PGPR自身的巨大潛力和帶來的商用價值，將其引入農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)林牧業(yè)、食品安全、環(huán)境保護(hù)等方面[19]，對創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境、降低化肥與農(nóng)藥的使用、抑制病蟲害的發(fā)生將有重要的作用，在保證現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的同時又可達(dá)到增產(chǎn)的目的。

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作者簡介：張振建，本科學(xué)歷，研究方向：發(fā)酵工程。

通訊作者：郭軍康，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：環(huán)境科學(xué)。