湯小朋 徐 榮 李成良 彭 鵬 禹琪芳 方熱軍

(湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南畜禽安全生產協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128)

磷(P)是生物系統(tǒng)的重要組成部分，涉及到各種生理過程，包括能量代謝、細胞信號、核苷酸和磷脂生物合成以及牙齒、骨骼形成[1-2]。研究已證實鈉磷轉運載體蛋白Ⅱb(type Ⅱb sodium-phosphate cotransporter, NaPi-Ⅱb)是介導腸道磷主動轉運的主要途徑[3-4]。NaPi-Ⅱb受許多因素的調節(jié)，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是調節(jié)其表達的重要因素之一[5-8]。EGF是一種重要的生長因子，廣泛存在于乳液、唾液、尿液、腸液、血液、羊水等體液中，對細胞生存、增殖與分化、遷移、凋亡等具有重要作用[9-11]。前人在人Caco2細胞及豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)中的研究表明，EGF可抑制細胞NaPi-Ⅱb的表達，說明在正常培養(yǎng)條件下，EGF可能通過其他途徑調節(jié)細胞對磷的吸收。理論上講，在EGF對腸道屏障功能的修復過程中，必然伴隨大量DNA、RNA和蛋白質的合成，其前提需要經腸道吸收更多的磷，此過程中所需更多的磷是通過何種途徑滿足機體需要還未見報道。因此，本研究通過細胞試驗與動物試驗相結合的方法，研究EGF對脂多糖(LPS)刺激的應激狀態(tài)下斷奶仔豬小腸磷吸收的影響，為進一步詮釋EGF對磷的吸收提供新的認識。

1 材料與方法

1.1 細胞試驗

1.1.1 主要試劑

EGF購自Peprotech公司；LPS、Tris、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、吐溫-20(Tween-20)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青鏈雙抗購自Gibco公司；DMEM/F12(HyClon)培養(yǎng)基購自GE公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白試劑盒、磷酸緩沖液(PBS)、RIPA蛋白裂解液購自索萊寶公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、UltraSYBR Mixture及DM 2000 Plus DNA Marker均購自北京康維世紀公司；Super ECL Plus超敏發(fā)光液購自Thermo公司；一抗NaPi-Ⅱb(貨號：21773-1-AP)、一抗β-肌動蛋白(β-actin)(貨號：60008-1-Ig)、二抗(Goat Anti-Rabbit IgG/HRP)購自Proteintech公司。

1.1.2 細胞培養(yǎng)及分組

IPEC-J2細胞由中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所提供。細胞經活化后，培養(yǎng)在含10% FBS、1%青鏈雙抗的培養(yǎng)基中，置于37 ℃，含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，顯微鏡下計數，收集的細胞用于細胞傳代或進行后續(xù)試驗。試驗設4個組：對照組(0 ng/mL EGF，0 μg/mL LPS)、EGF組(100 ng/ mL EGF，0 μg/mL LPS)、LPS組(0 ng/mL EGF，1.0 μg/mL LPS)、EGF+LPS組(100 ng/mL EGF，1.0 μg/mL LPS)，每組3個重復。EGF、LPS劑量的選擇及培養(yǎng)時間的確定參照文獻[11]。將細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL含10% FBS、1%青鏈雙抗的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用37 ℃ PBS潤洗2遍，然后分別加入相應劑量的EGF與LPS，加入培養(yǎng)基至2 mL，培養(yǎng)24 h。

1.1.3 EGF對LPS刺激的IPEC-J2細胞NaPi-ⅡbmRNA表達的測定

采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測細胞NaPi-ⅡbmRNA的表達。細胞培養(yǎng)結束后，用PBS洗滌細胞2次，每孔加入Trizol 1 mL，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，并測定總RNA濃度及1%瓊脂凝膠檢測RNA完整性。以細胞總RNA為模板，用逆轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，具體步驟參照試劑盒說明書。定量PCR反應按照熒光定量PCR檢測試劑盒操作。所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。NaPi-Ⅱb引物序列為F：GCCCGAGCTTAAGAACACA，R：CATGACACCAGCACCATCGTT；β-actin引物序列為F：CATCCTGCGTCTGGACCTGG，R：TAATGTCACGCACGATTTCC。實時熒光定量PCR程序參照Tang[11]介紹的方法進行。以β-actin基因為內參，采用2-△△Ct法進行目的基因相對表達量計算。

1.1.4 EGF對LPS刺激的IPEC-J2細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達的測定

采用Western blot檢測細胞NaPi-Ⅱb蛋白的表達。細胞培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞1次，加入250 μL RIPA細胞裂解液(含1 mmol/L蛋白酶抑制劑)，冰上裂解15 min，4 ℃，12 000 r/min離心3～5 min，取上清分裝后置于-80 ℃冰箱保存，待測。蛋白濃度測定采用南京建成的BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定，具體參照說明書步驟進行。Western blot程序參照Tang等[11]介紹的方法進行。

1.2 動物試驗

1.2.1 試驗材料

EGF由長沙某公司提供，EGF含量為4 000 mg/kg；LPS(大腸桿菌血清型O55∶B5)、石蠟、中性樹膠、伊紅購自Sigma公司；RT-PCR所需試劑同1.1.3。

1.2.2 試驗動物及分組

選取24頭體重接近、健康狀況良好的21日齡“長白×大白”二元雜交斷奶閹公豬[平均體重(5.76±0.38) kg]，隨機分為4個組：對照組(基礎飼糧)、EGF組(基礎飼糧+2 mg/kg EGF)、LPS組(基礎飼糧+腹腔注射100 μg/kg BW LPS)、EGF+LPS組(基礎飼糧+2 mg/kg EGF+腹腔注射100 μg/kg BW LPS)，每組6個重復，每個重復1頭豬，試驗期14 d。基礎飼糧配制參照NRC(2012)豬的營養(yǎng)需要，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在試驗的第8天、第15天清晨，給LPS組和EGF+LPS組仔豬注射100 μg/kg BW的LPS[12]，對照組和EGF組注射等量的生理鹽水。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 10 000 IU,VD31 500 IU,VE 60 mg,VK33 mg,VB11.8 mg,VB120.024 mg,核黃素riboflavin 6 mg,葉酸 folic acid 0.3 mg,生物素 biotin 4.5 mg,煙酸 nicotinic acid 24 mg,D-泛酸D-pantothenic acid 15 mg,膽堿 choline 1 000 mg,Zn 125 mg,Fe 120 mg,Cu 150 mg,I 0.3 mg,Se 0.3 mg。

2)粗蛋白質、總磷、鈣為實測值，其余為計算值。CP, total P, Ca were measured values, while others were calculated values.

1.2.3 飼養(yǎng)管理

本試驗于2017年11月12日至2017年11月29日在益陽兆豐農牧科技有限公司豬舍進行。試豬單欄飼養(yǎng)，試驗期間自由采食與飲水。每天08:00、12:00、16:00、20:00投喂飼糧，第2天投喂前收集剩余飼糧。每天中午通風15 min左右，豬舍溫度控制在25～28 ℃，相對濕度50%～70%。

1.2.4 樣品采集

血樣：試豬在試驗的第15天，注射LPS 6 h后，采集前腔靜脈血10 mL。血液樣品在4 ℃，3 500 r/min離心10 min，收集血清，-20 ℃保存。

黏膜樣：試豬在試驗的第15天，注射LPS 6 h后，全部仔豬注射50 mg/kg BW的戊巴比妥鈉，待完全麻醉后屠宰，屠宰后迅速從胸骨到恥骨切線打開腹腔，取出胃腸道，于空腸、回腸處分別采集約5 cm腸段，用4 ℃預冷1×PBS輕輕漂洗，于冰面上刮取黏膜，分裝2管，液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.2.5 EGF對LPS刺激的斷奶仔豬血清鈣、磷含量的測定

血清鈣含量的測定采用南京建成生物工程研究所生產的鈣測試盒(微板法，貨號C004-2)測定。血清磷含量的測定采用南京建成生物工程研究所生產的磷測試盒(磷鉬酸法，貨號C006)。測定步驟參照相應的試劑盒說明書進行。

1.2.6 EGF對LPS刺激的斷奶仔豬血清堿性磷酸酶(ALP)活性的測定

血清ALP活性采用邁瑞全自動生化分析儀(BS-200,深圳邁瑞醫(yī)療電子股份有限公司)檢測。試劑盒購自深圳邁瑞公司，測定步驟參照說明書進行。

1.2.7 腸黏膜NaPi-ⅡbmRNA表達的測定

采用qRT-PCR法測定空腸、回腸腸黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表達情況。具體操作同1.1.3。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗結果以“平均值±標準差”(means±SD)表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件的一般線性模型(GLM)進行兩因素方差分析，模型主效應包括EGF處理、LPS處理以及兩者的互作，one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，組間差異采用Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 EGF對LPS刺激的IPEC-J2細胞NaPi-Ⅱb mRNA表達的影響

由圖1可知，與對照組相比，EGF組細胞NaPi-ⅡbmRNA表達顯著下降(P<0.05)，EGF+LPS組細胞NaPi-ⅡbmRNA表達顯著提高(P<0.05)。與EGF組相比，EGF+LPS組細胞NaPi-ⅡbmRNA表達顯著提高(P<0.05)。與LPS組相比，EGF+LPS組細胞NaPi-ⅡbmRNA表達顯著提高(P<0.05)。EGF與LPS免疫應激的互作效應對NaPi-ⅡbmRNA表達影響顯著(P<0.05)。結果表明，EGF抑制細胞NaPi-ⅡbmRNA的表達，但在應激狀態(tài)下EGF促進細胞NaPi-ⅡbmRNA的表達。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，圖2、圖3同。

Values with different small letters mean significant difference (P<0.05), while with the same letter mean no significant difference (P>0.05). The same as Fig.2 and Fig.3.

圖1EGF對LPS刺激的IPEC-J2細胞NaPi-ⅡbmRNA表達的影響

Fig.1 Effects of EGF onNaPi-ⅡbmRNA expression in IPEC-J2 cells challenged by LPS

2.2 EGF對LPS刺激的IPEC-J2細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達的影響

由圖2可知，與對照組相比，EGF組細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達顯著下降(P<0.05)，EGF+LPS組細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達顯著提高(P<0.05)。與EGF組相比，EGF+LPS組細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達顯著提高(P<0.05)。與LPS組相比，EGF+LPS組細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達顯著提高(P<0.05)。EGF與LPS免疫應激的互作效應對NaPi-Ⅱb蛋白表達影響顯著(P<0.05)。Western blot結果同樣表明，EGF抑制細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達，但在應激狀態(tài)下EGF促進細胞NaPi-Ⅱb蛋白的表達。

2.3 EGF對LPS刺激的斷奶仔豬血清鈣、磷含量和ALP活性的影響

由表2可知，各組間血清鈣含量無顯著差異(P>0.05)；EGF與LPS免疫應激互作效應對血清鈣含量無顯著影響(P>0.05)。LPS組血清磷含量顯著高于對照組、EGF組、EGF+LPS組(P<0.05)，且EGF與LPS免疫應激互作效應對血清磷含量影響顯著(P<0.05)；EGF組血清ALP活性顯著高于LPS組(P<0.05)，與對照組、EGF+LPS組差異不顯著(P>0.05)，EGF與LPS免疫應激互作效應對血清ALP活性無顯著影響(P>0.05)。

2.4 EGF對LPS刺激的斷奶仔豬小腸黏膜NaPi-Ⅱb mRNA表達的影響

由圖3可知，與對照組相比，EGF組空腸(圖3-A)、回腸(圖3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表達均顯著降低(P<0.05)，EGF+LPS組空腸(圖3-A)、回腸(圖3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表達均顯著增加(P<0.05)。與LPS組相比，EGF組空腸(圖3-A)、回腸(圖3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表達均顯著降低(P<0.05)，EGF+LPS組空腸(圖3-A)、回腸(圖3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表達均顯著增加(P<0.05)。與EGF組相比，EGF+LPS組空腸(圖3-A)、回腸(圖3-B)黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表達均顯著增加(P<0.05)。EGF與LPS免疫應激互作效應對空腸與回腸NaPi-ⅡbmRNA的表達影響顯著(P<0.05)。動物試驗結果表明，EGF抑制小腸黏膜NaPi-ⅡbmRNA表達，但在應激狀態(tài)下促進小腸黏膜NaPi-ⅡbmRNA表達。

3 討 論

磷是動物必需的礦物質元素之一，在動物生長發(fā)育、骨骼形成、能量代謝、核酸合成、細胞信號轉導以及維持血液酸堿平衡中起著重要作用[1,3,13]。血清堿性磷酸酶是反映動物機體鈣磷代謝狀況的血清生化指標，當機體缺乏鈣磷時，堿性磷酸酶釋放增加。本研究結果表明，EGF對LPS刺激的仔豬血清鈣含量無顯著影響，但對血清磷含量影響顯著。EGF組血清ALP活性顯著高于LPS組，但飼糧EGF與LPS免疫應激互作效應對血清堿性磷酸酶活性無顯著影響。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁破裂后釋放的毒性物質，是導致急性腎損傷的主要因素之一[14]。本研究中LPS組血清磷含量顯著高于其他組，可能是LPS刺激導致了仔豬腎臟功能損傷，影響腎臟對磷的重吸收，從而導致血清磷含量異常升高。

A: Western blot電泳圖；B：NaPi-Ⅱb蛋白表達量。

A: Western blot electrophoretogram; B: NaPi-Ⅱb protein expression level.

圖2 EGF對LPS誘導的IPEC-J2細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達影響

同行數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

A：空腸NaPi-ⅡbmRNA相對表達量；B：回腸NaPi-ⅡbmRNA相對表達量。

A:NaPi-ⅡbmRNA relative expression level in the jejunum; B:NaPi-ⅡbmRNA relative expression level in the ileum.

圖3EGF對LPS刺激的斷奶仔豬小腸黏膜NaPi-ⅡbmRNA表達影響

Fig.3 Effects of EGF onNaPi-ⅡbmRNA expression in the small intestinal mucosa of weaned piglets challenged by LPS

腸道磷的吸收主要有被動擴散和主動吸收2種方式，NaPi-Ⅱb是調節(jié)腸道磷主動轉運的主要載體[3-5]，介導機體70%～90%磷的主動轉運[15-16]。NaPi-Ⅱb的調控受許多因素的影響，如磷[1]、維生素D3[17]、雌二醇[2]、神經肽Y[4]、降鈣素基因相關肽、EGF[5-8]等。EGF是一種含有53個氨基酸殘基的小肽，其生物學功能的發(fā)揮是通過與其表皮生長因子受體(EGFR)結合后實現(xiàn)的[9]。EGFR廣泛存在于小腸刷狀緣頂端及基底側，當動物攝取的EGF遞送到小腸黏膜后與EGFR結合，形成二聚物，激活酪氨酸激酶(RTK)活性，促進RTK自我磷酸化，隨后激活Ras/絲裂原活化蛋白激酶(Ras/MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、磷脂酶C-γ/蛋白激酶C(PLC-γ/PKC)等一系列的信號通路，對細胞生存、增殖與分化、遷移、凋亡等具有重要作用[9-11,18]。前人在人Caco2細胞中的研究表明，EGF通過修飾c-myb蛋白，經蛋白激酶C/蛋白激酶A(PKC/PKA)和MAPK信號通路調節(jié)下游啟動子功能，從而抑制細胞NaPi-Ⅱb的轉錄活性，降低其表達量[5-6]。本課題組在豬IPEC-J2細胞中同樣發(fā)現(xiàn)EGF抑制了細胞中NaPi-Ⅱb的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)EGF作用NaPi-Ⅱb啟動子區(qū)域位于-1 092～-1 085 bp區(qū)域(5′-TCCAGTTG-3′)，且EGF通過激活EGFR、PKA、PKC、P38、細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)、氨基末端激酶(JNK)等信號分子來下調IPEC-J2細胞中NaPi-Ⅱb的表達[7-8]。Tang等[11]研究表明，一定濃度的EGF可促進IPEC-J2細胞增殖，而細胞增殖過程中需要大量的磷用來合成RNA及DNA，說明EGF可促進磷的吸收，但不是通過NaPi-Ⅱb介導的磷的主動吸收，可能存在其他途徑介導磷的吸收。

應激是動物生產過程中的普遍現(xiàn)象，可導致動物腸道損傷，影響生產成績。LPS對小腸上皮細胞具有毒害作用，能刺激豬小腸上皮細胞分泌大量白介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細胞因子，最終導致炎癥的發(fā)生[19-21]。Tang等[11]研究表明，LPS刺激誘導了細胞氧化應激及細胞凋亡的發(fā)生，而EGF可通過緩解氧化應激減少細胞凋亡來保護LPS刺激的腸上皮細胞損傷。理論上講，在EGF對受損腸細胞修復過程中，必然伴隨大量DNA、RNA和蛋白質的合成，其前提需要經腸道吸收更多的磷，此過程中EGF是否解除對NaPi-Ⅱb表達的抑制作用，從而促進磷的主動吸收，以滿足機體對磷的需要，還未見報道。因此，本研究采用細胞試驗與動物試驗相結合的方法研究EGF對應激狀態(tài)下(LPS刺激)豬小腸磷吸收的影響，結果表明，EGF抑制IPEC-J2細胞的NaPi-ⅡbmRNA及蛋白的表達，抑制仔豬空腸與回腸黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表達，這與Xu等[4-5]、Xing等[6]、邢廷杰等[7]研究結果一致，而EGF可促進LPS刺激的IPEC-J2細胞NaPi-ⅡbmRNA及蛋白的表達，促進LPS刺激的斷奶仔豬空腸與回腸黏膜NaPi-ⅡbmRNA的表達，說明在非應激狀態(tài)下EGF抑制NaPi-Ⅱb介導的磷的主動轉運，在應激狀態(tài)下，EGF可解除對NaPi-Ⅱb的抑制，調控NaPi-Ⅱb介導的磷的主動吸收，以滿足機體對磷的需要，加快腸道修復進程。前人研究表明，EGF對斷奶仔豬的生長及腸道發(fā)育具有促進作用[22-23]，說明EGF是促進磷吸收，但不是通過NaPi-Ⅱb介導的磷的主動吸收。機體磷穩(wěn)態(tài)的維持是通過腸道磷吸收與腎臟磷重吸收實現(xiàn)的[24]。腸道磷吸收有被動擴散和主動轉運，除了NaPi-Ⅱb介導的主動轉運，Ⅲ型鈉離子依賴轉運載體蛋白(type Ⅲ transporters PiT1 and PiT2)也能介導部分磷的主動吸收[25]，腎臟重吸收主要由NaPi-Ⅱa與NaPi-Ⅱc 2種蛋白介導，當腸道磷吸收不足時，腎臟磷重吸收加強，從而滿足機體磷的需要[26]。因此，本研究中EGF可能通過增強腸道磷的被動擴散吸收，或通過增強PiT1和PiT2介導的磷主動轉運，或通過加強腎臟重吸收滿足機體磷的需要，但具體通過何種途徑調節(jié)磷的吸收還需進一步的研究。應激條件下EGF如何解除對NaPi-Ⅱb的抑制，從而介導磷的主動轉運以滿足機體需求還需進一步的研究。

4 結 論

EGF對腸道NaPi-Ⅱb的表達起抑制作用，但在免疫應激狀態(tài)下可促進NaPi-Ⅱb的表達。