陳宇光 秦龍山 賀 喜

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙410001)

脂聯(lián)素(adiponectin，ADIPOQ，又名Acrp30、apM1、GBP28)是由脂肪組織特異性分泌的一種脂肪細(xì)胞因子。研究表明，豬ADIPOQ基因定位在13號(hào)染色體上[1]，其全長(zhǎng)包含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子[2]，可編碼242個(gè)氨基酸，而人類ADIPOQ基因與豬的ADIPOQ基因相比存在2個(gè)氨基酸的差別，含有244個(gè)氨基酸。ADIPOQ蛋白結(jié)構(gòu)由4部分組成，即氨基端的信號(hào)序列、非同源序列、膠原樣結(jié)構(gòu)域以及羧基端具有生物活性的球狀結(jié)構(gòu)域。Yamauchi等[3]發(fā)現(xiàn)了脂聯(lián)素受體(adiponectin receptor，ADIPOR)，并通過表達(dá)克隆的方法首先將它們從人類骨骼肌中分離出來。ADIPOR包含2種亞型：ADIPOR1和ADIPOR2，其中，ADIPOR1主要在肌肉組織中表達(dá)，與ADIPOQ的球形結(jié)構(gòu)域有高度親和性；而ADIPOR2則主要表達(dá)于肝臟和脂肪組織中，與全長(zhǎng)ADIPOQ和ADIPOQ球形結(jié)構(gòu)域都具有中度親和性[4]。Ding等[5]首先成功地克隆出豬的ADIPOQ及ADIPOR，并發(fā)現(xiàn)ADIPOQmRNA大量存在于豬的脂肪、肝臟、心臟和肌肉等組織中。沙子嶺豬是脂肪沉積型動(dòng)物，我們?cè)谇捌谠囼?yàn)中已成功在沙子嶺豬中克隆出ADIPOQ基因并在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)[6]。因此，不同組織ADIPOR相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的變化對(duì)于進(jìn)一步明確ADIPOR與沙子嶺豬肉脂肪沉積規(guī)律的分子機(jī)制具有重要意義。本試驗(yàn)擬對(duì)沙子嶺豬不同組織器官中ADIPOQ、ADIPOR及其相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)量的發(fā)育性變化規(guī)律進(jìn)行研究，旨在為后續(xù)的深入研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：沙子嶺豬12只，購(gòu)買于湘潭沙子嶺原種豬場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

選取1、28、140日齡的沙子嶺豬各4頭，測(cè)定不同組織中ADIPOQ、ADIPOR1、ADIPOR2 mRNA和蛋白表達(dá)量的發(fā)育性變化及2型拓?fù)洚悩?gòu)酶β型(topoisomerase 2β，TOP2β)、TATA結(jié)合蛋白(TATA binding protein，TBP)mRNA表達(dá)量的發(fā)育性變化。

1.3 樣品采集與基因表達(dá)檢測(cè)

1.3.1 組織器官樣品采集

分別采取1、28和140日齡沙子嶺豬的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、背肌、背脂、腹脂和股肌，立即放入液氮，然后移入-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 組織器官樣品相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)

采用Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))法提取組織中總RNA，具體操作方法參照Simms等[7]，然后將RNA濃度調(diào)節(jié)一致，取1 000 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司(大連，中國(guó))，具體方法按說明書進(jìn)行。再利用實(shí)時(shí)定量熒光(real-time quantitative)PCR方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)量，引物均由維爾生物科技有限公司(長(zhǎng)沙)合成，基因的引物設(shè)計(jì)見表2。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR測(cè)定，每個(gè)樣本每個(gè)指標(biāo)3個(gè)孔，共30 μL體系，每孔10 μL，具體組成如下：Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 μL，Primer A(10 μmol/L)0.5μL，Primer B(10 μmol/L) 0.5 μL，PCR H2O 13 μL，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性10 s，39個(gè)循環(huán)，60 ℃退火50 s。以ADIPOQ、ADIPOR1、ADIPOR2、TOP2β和TBP為目的基因進(jìn)行相對(duì)定量，分析其mRNA表達(dá)量。

表1 基因的引物設(shè)計(jì)

1.3.2 組織器官樣品相關(guān)基因蛋白表達(dá)的檢測(cè)

主要試劑包括：Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，大連，中國(guó))、ADIPOQ抗體(Abcam，ab22554)、ADIPOR1抗體(Abcam，ab126611)、ADIPOR2抗體(Abcam，ab77612)、β-actin抗體(Abcam，ab8226)，所有引物均由維爾生物科技有限公司(長(zhǎng)沙)合成。

將組織樣品剪碎(20～30 mg)，按照質(zhì)量體積比=1∶2的比例加入裂解液，組織勻漿器勻漿至組織充分裂解，12 000×g,4 ℃離心10 min，取上清，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)定量試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。配制10%分離膠和5%濃縮膠，每孔20～30 μg總蛋白上樣，每孔10～15 μL，濃縮膠60 V、分離膠80 V電泳直至溴酚藍(lán)到底，停止電泳。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠在Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30 min，在冷卻條件下100 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，醋酸纖維素(PVDF)膜放到含5%脫脂奶粉的吐溫-Tris-鹽酸緩沖液(TBST)中室溫封閉1 h。TBST漂洗5 min，重復(fù)3次，ADIPOQ抗體、ADIPOR1抗體、ADIPOR2抗體和β-actin抗體分別按1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000和1∶2 000的比例溶于含5%脫脂奶粉的TBST中，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗5 min，重復(fù)3次。加入相應(yīng)種屬二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗5 min，重復(fù)3次。配制ECL工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1 min，保鮮膜密封，放置于化學(xué)發(fā)光儀(Image Quant LAS 4000 mini)選取適當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)行顯影后，采用Bandscan 5.0軟件分析計(jì)算條帶的光密度值，按以下公式對(duì)目的蛋白進(jìn)行相對(duì)定量。

目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白光密度值/β-actin光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 17.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行系統(tǒng)分析，若組間差異顯著，則采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著性標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織器官中ADIPOQ mRNA表達(dá)量的變化

由表2可知，隨著日齡的變化，除了心臟外，豬不同組織器官中ADIPOQmRNA表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)。相較于1日齡豬不同組織器官中ADIPOQmRNA表達(dá)量，28日齡豬心臟、肝臟、脾臟、腎臟、背肌、背脂、腹脂和股肌的表達(dá)量分別升高11.20%(P>0.05)、545.76%(P<0.01)、321.36%(P<0.01)、229.59%(P<0.01)、419.57%(P<0.01)、386.96%(P<0.01)、373.33%(P<0.01)和303.37%(P<0.01)；除心臟外，140日齡豬肝臟、脾臟、腎臟、背肌、背脂、腹脂和股肌7種組織器官中ADIPOQmRNA表達(dá)量較28日齡豬又出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其降幅分別達(dá)到16.40%(P>0.05)、62.67%(P<0.01)、66.87%(P<0.01)、80.13%(P<0.01)、77.23%(P<0.01)、41.55%(P<0.01)和94.15%(P<0.01)；除股肌中ADIPOQmRNA表達(dá)量較1日齡豬降低了76.40%(P<0.01)外，心臟、肝臟、脾臟、腎臟、背肌、背脂和腹脂較1日齡豬分別提高了30.40%(P>0.05)、439.83%(P<0.01)、57.28%(P<0.05)、9.18%(P>0.05)、3.26%(P>0.05)、10.87%(P>0.05)、176.67%(P<0.01)。

表2 不同組織器官中ADIPOQ mRNA表達(dá)量的變化

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 不同組織器官中ADIPOR1 mRNA表達(dá)量的變化

由表3可知，豬不同組織器官(除心臟外)中ADIPOR1 mRNA表達(dá)量隨日齡變化呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。28日齡豬肝臟、脾臟、腎臟、背肌、背脂、腹脂和股肌中ADIPOR1 mRNA表達(dá)量較1日齡豬分別提高了249.41%(P<0.01)、116.36%(P<0.01)、137.07%(P<0.01)、84.31%(P<0.05)、63.37%(P<0.05)、69.00%(P<0.05)和47.37%(P<0.05)；140日齡豬各組織器官中ADIPOR1 mRNA表達(dá)量較1和28日齡豬均極顯著升高(P<0.01)。

2.3 不同組織器官中ADIPOR2 mRNA表達(dá)量的變化

由表4可知，豬不同組織器官中ADIPOR2 mRNA表達(dá)量隨日齡變化呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。28日齡豬不同組織器官中ADIPOR2 mRNA表達(dá)量較1日齡豬均極顯著升高(P<0.01)，心臟、肝臟、脾臟、腎臟、背肌、背脂、腹脂和股肌增幅分別達(dá)到89.60%、164.23%、146.09%、132.17%、116.67%、94.34%、102.80%和92.52%；140日齡豬不同組織器官中ADIPOR2 mRNA表達(dá)量較1和28日齡豬均極顯著升高(P<0.01)。

表3 不同組織器官中ADIPOR1 mRNA表達(dá)量的變化

表4 不同組織器官中ADIPOR2 mRNA表達(dá)量的變化

2.4 不同組織器官中TBP mRNA表達(dá)量的變化

由表5可知，豬大部分組織器官中TBPmRNA表達(dá)量基本呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。其中，28日齡豬心臟和肝臟中TBPmRNA表達(dá)量較1日齡豬分別降低了37.32%(P>0.05)和9.33%(P>0.05)，而脾臟、腎臟、背肌、背脂、腹脂和股肌中TBPmRNA表達(dá)量則分別提高了30.11%(P>0.05)、20.63%(P>0.05)、245.78%(P<0.01)、75.41%(P>0.05)、194.44%(P<0.01)和445.45%(P<0.01)；140日齡豬不同組織器官中TBPmRNA表達(dá)量較1和28日齡豬均出現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)。

表5 不同組織器官中TBP mRNA表達(dá)量的變化

2.5 不同組織器官中TOP2β mRNA表達(dá)量的變化

由表6可知，28日齡豬肝臟和脾臟中TOP2βmRNA表達(dá)量較1日齡豬分別降低了66.13%(P<0.05)和11.46%(P>0.05)，而28日齡豬心臟、腎臟、背肌、背脂、腹脂和股肌中TOP2βmRNA表達(dá)量較1日齡豬分別提高了14.97%(P>0.05)、12.50%(P>0.05)、156.00%(P<0.01)、924.65%(P<0.01)、157.63%(P<0.01)和603.13%(P<0.01)；140日齡豬不同組織器官中TOP2βmRNA表達(dá)量較1和28日齡豬均出現(xiàn)極顯著提高(P<0.01)。豬大部分組織器官中TOP2βmRNA表達(dá)量基本逐漸升高的趨勢(shì)。

表6 不同組織器官中TOP2β mRNA表達(dá)量的變化

2.6 不同組織器官中ADIPOD蛋白表達(dá)量的變化

由表6可知，1和28日齡豬背肌、背脂、腹脂和股肌中ADIPOD蛋白的表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)；相較于1日齡豬，140日齡豬4個(gè)組織中ADIPOD蛋白的表達(dá)量分別降低了19.01%(P>0.05)、7.77%(P>0.05)、41.96%(P>0.05)和45.54%(P>0.05)，較28日齡豬分別降低了-4.26%(P>0.05)、12.84%(P>0.05)、39.81%(P>0.05)和54.92%(P<0.05)。除了背肌外，背脂、腹脂和股肌中ADIPOD蛋白的表達(dá)量在28～140日齡呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表7 不同組織器官中ADIPOD蛋白表達(dá)量的變化

2.7 不同組織器官中ADIPOR1蛋白表達(dá)量的變化

由表8可知，除腹脂中ADIPOR1蛋白的表達(dá)量略有升高(P>0.05)外，28日齡豬背肌、背脂和股肌中ADIPOR1蛋白的表達(dá)量較1日齡豬分別降低了3.88%(P>0.05)、0.96%(P>0.05)和5.45%(P>0.05)；140日齡豬不同組織中ADIPOR1蛋白的表達(dá)量均低于1和28日齡豬，降幅分別達(dá)到6.80%(P>0.05)、38.46%(P<0.05)、17.82%(P>0.05)、24.55%(P>0.05)和3.03%(P>0.05)、37.86%(P<0.05)、22.43%(P>0.05)、20.19%(P>0.05)。豬背肌、背脂和股肌中ADIPOR1蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。

2.8 不同組織器官中ADIPOR2蛋白表達(dá)量的變化

由表9可知，除股肌中ADIPOR2蛋白的表達(dá)量略有升高(P>0.05)外，28日齡豬背肌、背脂和腹脂中ADIPOR2蛋白的表達(dá)量較1日齡豬分別降低了12.61%(P>0.05)、4.31%(P>0.05)和1.65%(P>0.05)；除背肌外，140日齡豬背脂、腹脂和股肌組織中ADIPOR2蛋白的表達(dá)量均低于1和28日齡豬，降幅分別達(dá)到37.93%(P>0.05)、63.64%(P>0.05)、59.09%(P>0.05)和35.14%(P>0.05)、63.03%(P>0.05)、63.11%(P<0.05)。豬背肌和腹脂中ADIPOR2蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。

表8 不同組織器官中ADIPOR1蛋白表達(dá)量的變化

表9 不同組織器官中ADIPOR2蛋白表達(dá)量的變化

3 討 論

3.1 不同組織器官中ADIPOQ mRNA和蛋白表達(dá)量的變化

初生仔豬不同組織中ADIPOQmRNA表達(dá)量一般比較低，這和仔豬的自身?xiàng)l件有關(guān)，仔豬剛出生時(shí)前體脂肪較多，而成熟的細(xì)胞較少，而隨著仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育，前體脂肪細(xì)胞不斷分化為成熟的脂肪細(xì)胞，ADIPOQmRNA表達(dá)量也表現(xiàn)出大幅度的升高。Ramsay等[8]測(cè)定了新生仔豬1～21日齡脂肪組織中各種脂肪因子的發(fā)育性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADIPOQmRNA表達(dá)量顯著上升；此外，對(duì)兔子的研究也發(fā)現(xiàn)，ADIPOQ在不同年齡兔子體內(nèi)的表達(dá)差異極顯著[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，除了28日齡心臟外，其余組織中ADIPORmRNA表達(dá)量均顯著高于1日齡，這是因?yàn)樾呐K中脂肪含量較少，且ADIPOQ的分泌量較小，所以心臟中的變化不會(huì)太明顯。有研究而表明，肥胖會(huì)導(dǎo)致豬ADIPOQ的合成和分泌量減少[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著豬日齡的增加，不同組織中ADIPOQmRNA表達(dá)量大致呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)楹笃谪i通過自身脂肪的大量沉積，進(jìn)行自身調(diào)節(jié)，所以ADIPOQ蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)。

3.2 不同組織器官中ADIPOR1、ADIPOR2 mRNA和蛋白表達(dá)量的變化

動(dòng)物機(jī)體中ADIPOR1和ADIPOR2 mRNA和蛋白的表達(dá)量與脂肪沉積的狀態(tài)密切相關(guān)。一般情況下，隨著動(dòng)物年齡的增大，細(xì)胞分裂增殖等新陳代謝活動(dòng)逐漸增強(qiáng)，ADIPOQ及其受體的表達(dá)也會(huì)受其影響而不斷變化。Ocón-Grove等[11]研究發(fā)現(xiàn)，成年公雞睪丸中ADIPOR1及ADIPOR2 mRNA的表達(dá)量分別是青年雞的8.3和9.0倍；Pischon等[12]發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)鼠脂肪組織中，ADIPOQ含量開始時(shí)會(huì)不斷增加，直到第8～10周時(shí)才開始逐漸下降。在豬的初期生長(zhǎng)階段，前體脂肪細(xì)胞大量分化為成熟的脂肪細(xì)胞，包括后期脂肪的沉積階段脂肪細(xì)胞大量生長(zhǎng)，在這種情況下，ADIPOR1和ADIPOR2 mRNA表達(dá)量也會(huì)隨著成熟脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加而逐漸升高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，除了28日齡心臟中ADIPOR1 mRNA表達(dá)量要低于1日齡以外，各組織器官中ADIPOR1 mRNA表達(dá)量均隨日齡的增長(zhǎng)而升高；各組織器官中ADIPOR2 mRNA表達(dá)量也隨著日齡的增加而提高。mRNA表達(dá)量的升高不等同于蛋白表達(dá)量的升高，隨著豬的生長(zhǎng)，脂肪會(huì)大量的積累，在這種情況下，機(jī)體會(huì)自動(dòng)調(diào)節(jié)ADIPOR1和ADIPOR2蛋白的表達(dá)量，通過降解一部分ADIPOR1和ADIPOR2蛋白來確保脂肪組織的沉積，因此，隨著豬的生長(zhǎng)發(fā)育，ADIPOR1和ADIPOR2蛋白的表達(dá)量卻逐漸降低，這是由豬機(jī)體脂肪沉積的需要來進(jìn)行調(diào)節(jié)的。De Rosa等[13]發(fā)現(xiàn)肥肉型卡賽塔納豬肌肉、內(nèi)臟和腎臟周圍脂肪中ADIPOR蛋白的表達(dá)量均低于瘦肉型的長(zhǎng)白豬。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，除了28日齡時(shí)腹脂中ADIPOR1蛋白的表達(dá)量要高于1日齡以外，背肌、背腹脂和股肌中ADIPOR1蛋白的表達(dá)量均隨著日齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)；背肌和腹脂中ADIPOR2蛋白的表達(dá)量隨日齡的增加而降低。

3.3 不同組織器官中TOP2β和TBP mRNA表達(dá)量的變化

目前，對(duì)于動(dòng)物機(jī)體中TOP2β和TBPmRNA表達(dá)量的研究還比較少。在本研究中，除了28日齡時(shí)心臟和肝臟中TOP2βmRNA表達(dá)量要低于1日齡以外，各組織器官中TOP2βmRNA表達(dá)量均隨著日齡的增長(zhǎng)而呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)；除了28日齡時(shí)肝臟和脾臟中TBPmRNA表達(dá)量低于1日齡以外，各組織器官中TBPmRNA表達(dá)量均隨著日齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出顯著或極顯著升高。真核生物的TOP2β是同型二聚體酶，對(duì)于在普通的瞬時(shí)雙鏈DNA切割形成過程中改變DNA的拓?fù)鋵W(xué)具有非常關(guān)鍵的作用[14]，拓?fù)洚悩?gòu)酶對(duì)于DNA的復(fù)制、包裝、修復(fù)以及DNA拓?fù)鋵W(xué)上允許的變化的轉(zhuǎn)錄具有非常關(guān)鍵的作用；而TBP一個(gè)最重要的功能是促進(jìn)真核生物轉(zhuǎn)錄。隨著豬的生長(zhǎng)發(fā)育，機(jī)體細(xì)胞數(shù)量大幅增長(zhǎng)，TOP2β和TBPmRNA表達(dá)量也大幅度升高，這對(duì)于保證機(jī)體細(xì)胞的正常分裂具有十分重要的作用。

4 結(jié) 論

① 隨著豬的生長(zhǎng)，不同組織器官中ADIPOQmRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，而ADIPOR1和ADIPOR2 mRNA表達(dá)量則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)；ADIPOD、ADIPOR1和ADIPOR2蛋白的表達(dá)量在豬的生長(zhǎng)后期均出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

② 隨著豬的生長(zhǎng)，不同組織器官中TOP2β和TBPmRNA表達(dá)量也大幅度升高。

③ADIPOQ及相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)量與豬的脂肪沉積呈負(fù)相關(guān)，機(jī)體能根據(jù)自身需要對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)。