郭婷婷 胡丹丹 付子琳 李 娜 徐曉鋒

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川750021)

功能性寡糖具有調(diào)控動物胃腸道微生物生長和改變微生物區(qū)系組成的作用，甘露寡糖是功能性寡糖的一種。研究發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能夠改善單胃動物腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌群增殖[1-2]，增強(qiáng)免疫力[3]，提高動物生產(chǎn)性能[4]。在犢牛飼糧中添加的甘露寡糖在通過小腸時，與侵入病原菌的碳水化合物基團(tuán)結(jié)合，使病原菌既不能繁殖，又不能附著在犢牛的腸壁，被安全排出體外，而對乳酸菌等有益菌沒有負(fù)面影響[5]。近幾年研究人員在成年反芻動物上也進(jìn)行了甘露寡糖應(yīng)用研究，發(fā)現(xiàn)其在促進(jìn)瘤胃發(fā)酵、瘤胃菌群結(jié)構(gòu)等方面也具有積極作用。Heinrichs等[6]報道，甘露寡糖能夠優(yōu)化牛的胃腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)雙歧桿菌等有益菌的增殖，抑制大腸桿菌等致病菌的增殖。劉立恒等[7]研究報道，飼糧添加甘露寡糖與其他寡糖組合后，牛瘤胃液細(xì)菌的PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)圖譜條帶數(shù)明顯增加，經(jīng)測序，其中2個是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌屬。甘露寡糖作為主要功能性寡糖在單胃動物上研究較多，目前在反芻動物上的應(yīng)用研究也備受關(guān)注，但甘露寡糖如何改變瘤胃菌群結(jié)構(gòu)目前報道不一。為此，本研究基于16S rDNA高通量測序分析技術(shù)，探討添加甘露寡糖對奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)與多樣性的影響，為其在奶牛中的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘露寡糖購買于河南三化生物科技公司，純度為99%。

1.2 試驗(yàn)動物與飼糧

選擇4頭泌乳天數(shù)為20 d、日產(chǎn)奶量30 kg左右、體重為550 kg左右的經(jīng)產(chǎn)(二胎)中國荷斯坦泌乳奶牛作為試驗(yàn)動物。根據(jù)NRC(2001)奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制飼糧，精粗比為40∶60(DM基礎(chǔ))，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)動物采用全混合日糧(TMR)飼喂方式，日投料3次，自由采食。全天自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 14 000 IU，VD37 500 IU，VE 43 mg，Se 0.6 mg，Cu 30 mg，F(xiàn)e 358 mg，Mn 260 mg，鹽霉素鈉 salinomycin sodium salt 20 mg，桿菌肽鋅 zinc bacitracin 100 mg，硫酸桿菌 sulfuric acid bacillus 39 mg。

2)產(chǎn)奶凈能為計(jì)算值[8]，其他為實(shí)測值。NELwas a calculated value[8], while the others were measured values.

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將試驗(yàn)牛隨機(jī)分為2組，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧，同時添加60 g/頭甘露寡糖(參照劉立恒等[7])，通過口腔灌注添加。采用2×2交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每期21 d，其中預(yù)試期14 d，采樣期7 d。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 瘤胃液采集

通過?？谇粚?dǎo)管采集瘤胃液，準(zhǔn)備牛鼻夾把牛頭固定，在口腔中放入硬管(硬塑膠，內(nèi)徑要超過取樣軟管)，插入深度不要超過咽部，外面露出20 cm左右，工作人員能夠用手把其固定，然后把軟管(2.5 m左右)通過口腔硬管內(nèi)徑逐步送入瘤胃，將牛頭壓低，通過牛的咀嚼過程使瘤胃液自然流出。

1.4.2 瘤胃液的處理

將采集的瘤胃液轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用4層紗布過濾，將過濾后的瘤胃液等量混勻。pH直接用比色計(jì)測定；取20 mL瘤胃液于50 mL離心管中，然后將部分轉(zhuǎn)移至含有3 mL 25%偏磷酸和0.6% 2-乙基丁酸的10 mL離心管，于-20 °C的冰箱內(nèi)保存，用于揮發(fā)性脂肪酸濃度的測定。揮發(fā)性脂肪酸濃度采用氣相色譜法[9](Agilent-6890N氣相色譜儀)測定；另取50 mL瘤胃液于離心管中，放置于-80 ℃冰箱凍存，用于菌群結(jié)構(gòu)分析，共有8個樣品，其中添加甘露寡糖的試驗(yàn)組4個樣品(MT-1、MT-2、MT-3、MT-4)，沒有添加甘露寡糖的對照組4個樣品(CK-1、CK-2、CK-3、CK-4)。

1.5 DNA樣品提取、擴(kuò)增

1.5.1 DNA提取

DNA采用試劑盒提取，試劑盒采購于南京建成生物工程研究所，提取步驟參照試劑盒中的說明書操作。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增前用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的純度和濃度，于離心管中取適量的樣品進(jìn)行稀釋。將稀釋后的基因組DNA作為模板。瘤胃液DNA擴(kuò)增目的片段為V3+V4區(qū)，大概長度468 bp，V3+V4區(qū)引物為341F-806R[10]，引物序列為341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。

1.6 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用膠濃度為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；依照PCR產(chǎn)物濃度的檢測結(jié)果進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用膠濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用南京建成生物工程研究所提供的回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.7 Miseq測序

將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行Miseq測序，測序采用Miseq 2500 PE 250平臺。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行初步處理，采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件中的兩階段交叉設(shè)計(jì)資料的方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露寡糖對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表2可以看出，試驗(yàn)組奶牛瘤胃液pH與對照組相比提高了2.46%(P>0.05)。與對照組相比，添加甘露寡糖極顯著提高了瘤胃液乙酸的濃度(P<0.01)，乙酸/丙酸提高了8.47%(P>0.05)。

表2 甘露寡糖對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter superscript mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 16S rDNA基因V3+V4區(qū)域擴(kuò)增結(jié)果

對照組和試驗(yàn)組每組取4個樣，共取8個瘤胃液樣品。對8個瘤胃液樣品總DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，檢測結(jié)果表明，濃度及純度均符合Illumina Miseq平臺測序要求，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。對不同樣品基因組DNA進(jìn)行16S rDNA基因V3+V4區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增的條帶大小正確，濃度合適且條帶單一，如圖1所示，適合后續(xù)測序試驗(yàn)。

9、10、17、18為對照組樣品，1、2、25、26為試驗(yàn)組樣品。

9, 10, 17 and 18 were samples of control group, 1, 2, 25 and 26 were samples of experimental group.

圖1樣本16SrDNA基因V3+V4區(qū)域擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 Amplification results of V3+V4 region of 16S rDNA gene of samples

2.3 奶牛瘤胃菌群基因序列及多樣性分析

2.3.1 操作分類單位(OTU)數(shù)量

經(jīng)Illumina Miseq測序結(jié)束后，除去低質(zhì)量序列，通過序列拼接，應(yīng)用Mothur，根據(jù)97%的序列相似度，對序列進(jìn)行OTU劃分。根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，分析不同樣品的聚類信息，依照其共有、特有的OTU信息繪制韋恩圖(Venn graph)，由圖2可知，添加甘露寡糖后奶牛瘤胃液菌群多樣性降低。

CK：對照組；MT：試驗(yàn)組。

CK: control group; MT: experimental group.

圖2奶牛瘤胃液菌群韋恩圖

Fig.2 Venn graph of microflora in rumen fluid of dairy cows

2.3.2 Alpha多樣性分析

2.3.2.1 OTU稀釋曲線和OTU Shannon稀釋曲線

為了檢測測序得到的數(shù)據(jù)能否科學(xué)充分反映試驗(yàn)組與對照組瘤胃液菌群的分布情況，本試驗(yàn)根據(jù)獲得的OTU數(shù)據(jù)，以隨機(jī)抽取的序列數(shù)與OTU數(shù)量來構(gòu)建曲線，做出每個樣品的稀釋曲線，可用來說明樣本測序數(shù)據(jù)量是否足以反映物種多樣性。從圖3、圖4中可以看出，測序深度較小時，OTU數(shù)量變化劇烈，OTU數(shù)量隨著測序深度的增加而大幅增加，當(dāng)測序深度達(dá)到5 000 reads時，稀釋曲線仍有上升趨勢，表明瘤胃內(nèi)仍有新的細(xì)菌尚未被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)測序深度達(dá)5 000 reads時，Shannon曲線已達(dá)到飽和狀態(tài)，說明測序趨向飽和，即當(dāng)前的測序量足夠進(jìn)行樣品菌群多樣性分析。

2.3.2.2 OTU Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)等[11]。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)是根據(jù)所測得的Tags數(shù)量和OTU的數(shù)量以及相對比例來預(yù)測樣品中微生物的種類(OTU的數(shù)量)，是基于已知結(jié)果所得相對值。Shannon指數(shù)是一個綜合反映OTU豐度和OTU均勻度2方面因素的一個多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)越大，越接近于0，則表示該樣品中的物種越豐富。

由表3可知，試驗(yàn)組的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均低于對照組，說明添加甘露寡糖使得奶牛瘤胃中細(xì)菌豐富度指數(shù)降低；Shannon指數(shù)小于對照組，Simpson指數(shù)大于對照組，說明添加甘露寡糖使得奶牛瘤胃中細(xì)菌多樣性降低，并且覆蓋率均大于93%，說明樣品采集足以反映瘤胃菌群情況。

圖3 奶牛瘤胃細(xì)菌OTU稀釋曲線

圖4 奶牛瘤胃細(xì)菌OTU Shannon稀釋曲線

項(xiàng)目Items對照組Control group試驗(yàn)組Experimental groupSEMP值P-value豐富度指數(shù) Richness indexACE指數(shù) ACE index7 800.0726 767.640730.0400.524Chao1指數(shù) Chao1 index5 972.2705 564.692288.2010.429多樣性指數(shù) Diversity indexShannon指數(shù) Shannon index6.3286.2950.0140.734Simpson指數(shù) Simpson index0.0070.0090.000 0.485覆蓋率 Coverage/%93.900b95.300a0.0000.018

2.4 瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平

由圖5、表4可知，奶牛瘤胃液中總共涉及29個門，包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形細(xì)菌門(Proteobacteria)、螺旋菌門(Spirochaetes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobi)、絲狀桿菌門(Fibrobacteres)、軟壁菌門(Tenericutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、放線菌門(Actinobacteria)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、梭桿菌門(Fusobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)等。其中擬桿菌門、厚壁菌門和變形細(xì)菌門占到總菌群比例的90%。與對照組相比，添加甘露寡糖極顯著降低了奶牛瘤胃液中藍(lán)藻門的相對豐度(P<0.01)，極顯著提高了裝甲菌門相對豐度(P<0.01)；添加甘露寡糖可以降低瘤胃液中螺旋菌門、絲狀桿菌門、梭桿菌門、酸桿菌門的相對豐度，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.4.2 屬水平

進(jìn)一步細(xì)化分類水平到屬，本試驗(yàn)?zāi)膛Ａ鑫敢壕嚎偣采婕?19個屬種。由圖6和表5可知，表中共顯示豐度相對較高的25個屬種占各樣品總菌屬91%以上，其中13個菌屬的相對豐度較高，分別為普雷沃式菌屬(Prevotella)、NA、S24-7_NA、未注釋琥珀酸弧菌屬(Succinivibrionaceae_NA)、未注釋毛螺菌屬(Lachnospiraceae_NA)、未注釋瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_NA)、未注釋普雷沃氏菌屬(Prevotellaceae_NA)、解琥珀酸弧菌屬(Succiniclasticum)、瘤胃球菌屬(Ruminococcu)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、梅毒螺旋屬(Treponema)、Shuttleworthia、糞球菌屬(Coprococcus)。試驗(yàn)組錐形桿菌屬(Pyramidobacter)的相對豐度極顯著低于對照組(P<0.01)，梭菌屬(Clostridium)的相對豐度顯著低于對照組(P<0.05)。試驗(yàn)組與纖維素降解有關(guān)的瘤胃球菌屬、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)的相對豐度，較對照組分別增加了24.34%、12.83%(P>0.05)。試驗(yàn)組與半纖維素分解有關(guān)的厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)。試驗(yàn)組未注釋毛螺菌屬相對豐度較對照組增加了8.16%(P>0.05)。試驗(yàn)組與淀粉降解有關(guān)的普雷沃氏菌屬的相對豐度較對照組降低了4.66%(P>0.05)。試驗(yàn)組利用乳酸為主的未注釋韋榮氏菌屬(Veillonellaceae_NA)的相對豐度較對照組提高了143.11%(P>0.05)。試驗(yàn)組氧化乳酸的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)的相對豐度較對照組提高了4.88%(P>0.05)。

圖5 門水平上瘤胃菌群分布圖

圖6 屬水平上瘤胃菌群分布圖

續(xù)表5屬Genus對照組Control group試驗(yàn)組Experimental groupSEMP值P-value差異倍數(shù)log2值log2 fold changeRFP12_NA0.2940.3000.0590.9680.031假丁酸弧菌屬Pseudobutyrivibrio0.2650.2990.0670.8710.181毛螺菌屬 Lachnospira0.2610.3440.1210.7430.400脫硫弧菌屬 Desulfovibrio0.2460.2580.0220.8950.070假單胞菌屬 Pseudomonas0.0430.0330.0040.822-0.377錐形桿菌屬 Pyramidobacter0.019A0.007B0.0150.007-1.482厭氧螺菌屬 Anaerobiospirillum0.015b0.025a0.0000.0320.778

2.5 樣品組間差異LEFse分析

利用LEFse軟件對差異組間進(jìn)行分析，LEFse先對所有組樣品間進(jìn)行kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)(一種多樣本比較時常用的檢驗(yàn)方法)，將篩選出的差異再通過wilcoxon秩和檢驗(yàn)(一種兩樣本成組比較常用的檢驗(yàn)方法)進(jìn)行兩兩組間比較，最后篩選出的差異使用線性判斷分析(LDA)得出的結(jié)果進(jìn)行排序得到圖7-A。圖7-A展示了不同組中相對豐度差異顯著的物種(LDA score大于預(yù)設(shè)值的顯著差異物種)，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小(即為LDA score)。隨后通過將差異映射到已知層級結(jié)構(gòu)的分類樹上的方式得到進(jìn)化分支圖(圖7-B)。在進(jìn)化分支圖中，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬(或種)的分類級別。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。著色原則：無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色。由圖7-A和圖7-B可知，試驗(yàn)組裝甲菌門(Armatimonadetes)、RB046、SJA_176、金氏菌屬(Kingella)和無膽甾原體目(Acholeplasmatales)的相對豐度較對照組顯著增加；錐形桿菌屬、藍(lán)藻菌屬(Cyanobacteria)、4C0d_2、YS2和瘤菌屬(Ruminicola)的相對豐度較對照組顯著降低。

A :LDA值分布柱狀圖；B ：進(jìn)化分支圖。 CK：對照組；MT：試驗(yàn)組。

A: LDA value distribution histogram; B: cladogram. CK: control group; MT: experimental group.

圖7LEFse差異分析圖

Fig.7 LEFse difference analysis diagram

3 討 論

瘤胃中的微生物是反芻動物不可缺少的消化菌群，瘤胃為微生物提供相對穩(wěn)定的生存環(huán)境，瘤胃微生物主要包括細(xì)菌、原蟲和真菌。其中細(xì)菌含量極其豐富，且種類繁多，大量的研究表明擬桿菌門和厚壁菌門是哺乳動物胃腸道的優(yōu)勢菌群[12-15]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添加甘露寡糖后奶牛瘤胃中菌群多樣性降低。閔力[16]研究發(fā)現(xiàn)，添加功能性寡糖組合可以增加瘤胃液微生物種類，而且促進(jìn)部分瘤胃液細(xì)菌的生長繁殖，使其成為優(yōu)勢菌群。本研究發(fā)現(xiàn)，添加甘露寡糖極顯著降低了奶牛瘤胃液藍(lán)藻門的相對豐度，極顯著提高裝甲菌門的相對豐度。Derakhshani[17]報道奶牛產(chǎn)后瘤胃裝甲菌門豐度降低，其原因有可能是基于奶牛產(chǎn)后飼糧變化、能量負(fù)平衡等生理應(yīng)激，產(chǎn)后奶牛飼糧精粗比增加，纖維比例降低，裝甲菌門有可能以纖維素和半纖維素為碳源。但Lee[18]研究發(fā)現(xiàn)，非纖維碳水化合物能夠顯著促進(jìn)裝甲菌門細(xì)菌的生長。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加甘露寡糖可以促進(jìn)裝甲菌門菌群的增殖，甘露寡糖為β-葡聚糖，主要化學(xué)結(jié)構(gòu)為β-1,3葡聚糖和β-1,6葡聚糖，完全不同于淀粉的主要化學(xué)結(jié)構(gòu),也不同于纖維素的β-1,4葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

粗飼料是反芻動物主要的飼料來源，粗飼料中纖維物質(zhì)在瘤胃微生物與瘤胃的共同作用下快速降解,轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)物質(zhì)以滿足反芻動物的能量需求[19]。細(xì)菌和真菌在分解利用纖維素過程中起著主要作用，細(xì)菌、原蟲和真菌通過酶的催化使纖維素和半纖維素分解為瘤胃能夠吸收的小分子物質(zhì)[20]，其中纖維素分解菌對纖維素的降解作用尤為重要。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添加甘露寡糖使得與纖維素降解有關(guān)的瘤胃球菌屬和假丁酸弧菌屬的相對豐度分別增加24.34%、12.83%。通過瘤胃發(fā)酵參數(shù)可以看出，試驗(yàn)組奶牛瘤胃pH與對照組相比提高了2.46%,為瘤胃纖維降解菌的增殖提供了適宜的pH。劉力恒等[7]添加功能性寡糖組合后，牛瘤胃液中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌屬相對豐度增加，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃主要纖維降解菌。本研究發(fā)現(xiàn)，添加甘露寡糖顯著提高了奶牛瘤胃中與半纖維素分解有關(guān)的厭氧螺菌屬的相對豐度，試驗(yàn)組未注釋毛螺菌屬相對豐度較對照組增加了8.16%。閔力[16]研究報道，在添加甘露寡糖等功能性寡糖的組合后，錦江黃牛瘤胃液細(xì)菌PCR-DDGE產(chǎn)生了12個特異性條帶，經(jīng)測序分析，其中2株為產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，提高了瘤胃對纖維的降解率，提高粗飼料降解率。

奶牛瘤胃中廣泛存在著降解和利用淀粉的普雷沃氏菌屬[21]。本試驗(yàn)中，添加甘露寡糖后,試驗(yàn)組奶牛瘤胃中與淀粉降解有關(guān)的普雷沃氏菌屬相對豐度較對照組降低了4.66%。由本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，普雷沃氏菌屬相對豐度達(dá)到了49%以上，是瘤胃主要的細(xì)菌菌屬。閔力[16]研究報道，在錦江黃牛的飼糧中添加功能性寡糖組合后瘤胃中增加了1株棲瘤胃普雷沃氏菌屬，但并未見瘤胃普雷沃氏菌屬豐度變化的報道。添加甘露寡糖之后，奶牛瘤胃梭菌屬相對豐度極顯著降低，通過本試驗(yàn)可以看出其相對豐度僅占0.5%左右，說明梭菌屬并不是瘤胃主要菌屬。雖然不是瘤胃中的主要細(xì)菌，但其在瘤胃中的種類多，有纖維降解梭菌(Clostridiumfibrinolysis)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyrate)，還有菌株可降解蛋白質(zhì)[22]，而且從飼喂高含量淀粉的反芻動物瘤胃中可以分離得到丁酸梭菌[23]，丁酸梭菌水解淀粉但不水解纖維素，水解淀粉和糖類的最終代謝產(chǎn)物為丁酸、乙酸和乳酸。與對照組相比，添加甘露寡糖極顯著提高了瘤胃液乙酸的濃度，乙酸/丙酸提高了8.47%。同時本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加甘露寡糖后瘤胃中以利用乳酸為主的未注釋韋榮氏菌屬相對豐度提高了143.11%，氧化乳酸的脫硫弧菌屬相對豐度提高了4.88%。與對照組相比，添加甘露寡糖極顯著提高了瘤胃乙酸的濃度，但添加甘露寡糖后瘤胃pH比對照組提高了2.46%。與乙酸、丁酸等揮發(fā)性有機(jī)酸比較，乳酸的酸性更強(qiáng)，對瘤胃pH的貢獻(xiàn)更大，甘露寡糖對于瘤胃pH的調(diào)控有可能是以利用淀粉為主的菌屬與以利用乳酸為主的未注釋韋榮氏菌屬綜合作用的結(jié)果，但具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)條件下，添加甘露寡糖降低了奶牛瘤胃菌群的多樣性，門水平上，藍(lán)藻門相對豐度極顯著降低，裝甲菌門相對豐度極顯著提高;屬水平上，與半纖維素分解有關(guān)的厭氧螺菌屬的相對豐度顯著提高，與淀粉降解有關(guān)的梭菌屬相對豐度顯著降低。

② 添加甘露寡糖可以增加與纖維降解有關(guān)的奶牛瘤胃主要菌屬瘤胃球菌屬、假丁酸弧菌屬以及毛螺菌屬的相對豐度，降低了與淀粉降解有關(guān)的普雷沃菌屬相對豐度，提高了利用乳酸為主的未注釋韋榮氏菌屬以及氧化乳酸的脫硫弧菌屬的相對豐度，但差異均不顯著。

③ 添加甘露寡糖顯著增加了奶牛瘤胃液乙酸濃度，提高了瘤胃液pH，但具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。