王 根 陳 暉 趙 芳 高 超 趙國(guó)棟 李曉斌 馬 晨 楊開倫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

哺乳動(dòng)物體內(nèi)褪黑素(melatonin，MT)是主要由松果體合成和分泌的一種吲哚類激素，廣泛分布在很多器官、組織和細(xì)胞中[1-2]。研究顯示，MT可促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞成熟[3]、維持精子功能[4]、促進(jìn)胚胎發(fā)育[5]和提高機(jī)體的抗氧化能力[6]，因此適當(dāng)提高血漿MT含量可能對(duì)綿羊生殖和機(jī)體健康具有重要的意義。色氨酸(tryptophan，Trp)作為動(dòng)物體內(nèi)合成MT的前體物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)羥化、脫羧、乙?；图谆纬蒑T。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，補(bǔ)喂瘤胃保護(hù)性色氨酸(rumen protected tryptophan，RPTrp)可提高綿羊血漿總Trp和游離Trp含量，同時(shí)犬尿氨酸(kynurenine，Kyn)含量也升高。提高Trp轉(zhuǎn)化為MT合成量首先要提高5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)合成量，而四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)是Trp合成5-HT的關(guān)鍵酶色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)的輔酶[7]。亞葉酸鈣(calcium folinate，CF)是葉酸的衍生物，經(jīng)吸收后可直接提供葉酸在體內(nèi)的活化形式，具有穩(wěn)定BH4的作用[8-9]。因此，本試驗(yàn)選擇綿羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，在RPTrp飼糧中添加CF，探究CF對(duì)調(diào)控反芻動(dòng)物體內(nèi)MT合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年7月30日至2017年8月14日在新疆惠康畜牧生物科技有限公司羊場(chǎng)、自然光照條件下進(jìn)行。采集血樣當(dāng)天日出時(shí)間為07:12，日落時(shí)間為21:15，晝長(zhǎng)14.03 h。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇(3.0±0.5)歲、平均體重(64.45±3.48) kg的健康薩福克綿羊15只。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將15只薩?？司d羊隨機(jī)分為3組，每組5只，分別為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組。所有試驗(yàn)羊只飼喂同一營(yíng)養(yǎng)水平精料補(bǔ)充料(購(gòu)自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司)，每天每只羊精料補(bǔ)充料飼喂量為12 g/kg BW、RPTrp(購(gòu)自北京亞禾營(yíng)養(yǎng)高新技術(shù)有限公司，Trp含量≥45%，過(guò)瘤胃率≥85%)為222.2 mg/kg BW(補(bǔ)喂量參考Itabashi等[10]的研究結(jié)果)、玉米青貯為1.8 kg，混合干草(苜?！名溄?1∶1)為自由采食，自由飲水，在此基礎(chǔ)上，試驗(yàn)Ⅰ組每天每只羊添加50 mg的CF(購(gòu)自上海柯維化學(xué)技術(shù)有限公司)，試驗(yàn)Ⅱ組每天每只羊添加100 mg的CF(添加量參考Ravaud等[11]的研究結(jié)果)。精料補(bǔ)充料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，玉米青貯、苜蓿和麥秸的營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表1 精料補(bǔ)充料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克精料補(bǔ)充料提供 The premix provided the following per kg of the concentrate supplement：VA 480 IU，VB1816 mg，VB2333 mg，VB649 mg，VD 70 IU，VE 21 333 IU，泛酸 pantothenic acid 20 mg，煙酰胺 nicotinamide 485 mg，Cu (as copper sulfate) 11 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 35 mg，Mn (as manganese sulfate) 33 mg，Zn (as zinc sulfate) 31 mg，I (as potassium iodide) 2 mg，Se (as sodium selenite) 6 mg，Co (as cobalt chloride) 1 mg。

2)營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值。Nutrient levels were measured values.

表2 玉米青貯、苜蓿干草、麥秸的營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值。Nutrient levels were measured values.

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羊只單欄位飼養(yǎng)，每天每只羊的RPTrp、CF、精料補(bǔ)充料和玉米青貯平均分成2份，分別于08:00、20:00飼喂。為保證RPTrp和CF采食完全，先將RPTrp、CF與50 g精料補(bǔ)充料混勻后飼喂，待綿羊采食完畢后再投喂剩余精料補(bǔ)充料、玉米青貯，自由采食混合干草和飲水。根據(jù)試驗(yàn)羊場(chǎng)的飼養(yǎng)管理規(guī)定，定期打掃圈舍。

1.5 樣品的采集與處理

于試驗(yàn)的第16天采集血樣，采集時(shí)間點(diǎn)為上午飼喂前0 h(07:30)、飼喂后1.5、3.0、4.5、6.0、8.0、10.0、12.0 h，通過(guò)頸靜脈采集血液至肝素鈉抗凝采血管中，3 500 r/min離心15 min制備血漿，分裝至1.5 mL Eppendorf管中，標(biāo)記后-20 ℃冰箱中冷凍保存。

1.6 指標(biāo)的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定血漿Trp、Kyn含量[12]。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿5-HT、MT含量；上午飼喂前0 h血漿總抗氧化能力(T-AOC)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量采用比色法測(cè)定，樣品均送至北京華英生物技術(shù)研究所進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著則用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。用P≤0.01、P≤0.05和0.05

2 結(jié) 果

2.1 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿Trp含量的影響

由表3可知，上午飼喂后0～12.0 h期間，各組間綿羊血漿Trp含量差異均不顯著(P>0.05)，變化趨勢(shì)基本一致；在上午飼喂后6.0和8.0 h時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組血漿Trp含量有降低的趨勢(shì)(P=0.087 2、P=0.053 1)。

表3 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿Trp含量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant different (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant different (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿Kyn含量的影響

由表4可知，上午飼喂后0～12.0 h期間，各組綿羊血漿Kyn含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，其中在上午飼喂后4.5～10.0 h期間，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組血漿Kyn含量有降低的趨勢(shì)(P=0.094 8、P=0.066 7、P=0.090 9、P=0.054 2)。

2.3 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿5-HT含量的影響

由表5可知，上午飼喂后0～8.0 h期間，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組綿羊血漿5-HT含量均有所提高，各組間變化趨勢(shì)相似，但各組間差異不顯著(P>0.05)；其中在上午飼喂后4.5和8.0 h時(shí)，試驗(yàn)組血漿5-HT含量有增加的趨勢(shì)(P=0.080 7、P=0.054 1)；在上午飼喂后10.0 h時(shí)，試驗(yàn)組極顯著高于對(duì)照組(P=0.005 7)，試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿Kyn含量的影響

表5 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿5-HT含量的影響

2.4 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿MT含量的影響

由表6可知，上午飼喂后0～8.0 h期間，各組間綿羊血漿MT含量差異不顯著(P>0.05)，但在上午飼喂后6.0和8.0 h時(shí)，試驗(yàn)組MT含量有增加的趨勢(shì)(P=0.089 0、P=0.070 4)。上午飼喂后8.0～10.0 h期間，對(duì)照組綿羊血漿MT含量呈下降趨勢(shì)，上午飼喂后10.0 h時(shí)為白天含量最小值，而試驗(yàn)組呈上升趨勢(shì)，上午飼喂后10.0 h時(shí)極顯著高于對(duì)照組(P=0.000 2)。

2.5 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿抗氧化能力的影響

由表7可知，上午飼喂前0 h，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ組綿羊血漿T-AOC、GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅰ組T-AOC也顯著提高(P<0.05)，但試驗(yàn)Ⅰ組血漿GSH-Px活性、MDA含量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。各組間血漿SOD活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿Trp、Kyn含量的影響

本試驗(yàn)中，上午飼喂后0～12 h期間，各組間綿羊血漿Trp含量無(wú)顯著性差異，但試驗(yàn)組均低于對(duì)照組，且在上午飼喂后6.0和8.0 h時(shí)有降低的趨勢(shì)。研究顯示，CF是葉酸的衍生物，具有穩(wěn)定和促進(jìn)機(jī)體BH4合成的作用[8]。本試驗(yàn)結(jié)果可能與添加CF提高了綿羊體內(nèi)BH4的含量和TPH的活性、促進(jìn)Trp沿5-HT途徑分解為5-羥色氨酸有關(guān)。本試驗(yàn)中，上午飼喂后4.5～10.0 h期間，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組綿羊血漿Kyn含量有降低的趨勢(shì)，與血漿Trp含量的變化趨勢(shì)基本一致。研究表明，動(dòng)物體內(nèi)約95%的L-Trp在色氨酸-2,3雙加氧酶(tryptophan-2,3-dioxygenase，TDO)和吲哚胺-2,3雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)作用下生成Kyn[13]。正常生理情況下，TDO是肝內(nèi)催化Trp形成Kyn關(guān)鍵酶，活性主要受底物Trp和激素(糖皮質(zhì)激素和雌激素)水平的影響[14-15]，而IDO主要在機(jī)體受感染、炎癥或應(yīng)激時(shí)肝外組織發(fā)揮作用[16]。本試驗(yàn)中，添加CF可能對(duì)綿羊肝內(nèi)TDO活性無(wú)顯著影響，血漿Kyn含量降低可能與添加CF提高了綿羊體內(nèi)TPH活性或表達(dá)量有關(guān)。

表6 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿MT含量的影響

表7 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿抗氧化能力的影響

3.2 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿5-HT、MT含量的影響

本試驗(yàn)中，上午飼喂后0～8.0 h期間，試驗(yàn)組綿羊血漿5-HT含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著性升高，但在上午飼喂后4.5和8.0 h時(shí)有升高的趨勢(shì)。研究顯示，動(dòng)物體內(nèi)TPH主要有2種不同基因編碼的亞型TPH1和TPH2。TPH1主要分布在腸嗜鉻細(xì)胞和松果體中，TPH2主要分布于腸神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT神經(jīng)元中[17-19]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，BH4含量并不能使TPH2飽和，因此，直接向腦室注入10 μL濃度為20 nmol/L的BH4或通過(guò)微透析灌注BH4的類似物四氫生物蝶呤二鹽酸均可顯著增加小鼠腦部組織TPH2活性和5-HT含量[20-21]。能否通過(guò)提高血漿BH4含量進(jìn)而提高TPH1活性和血漿5-HT含量還未見報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果可能是CF添加量不足或CF在瘤胃中降解而導(dǎo)致，對(duì)TPH1活性無(wú)顯著性影響。本試驗(yàn)中CF添加量是參考胃癌患者化療時(shí)口服CF量(90 mg/d)設(shè)置[11]，目前尚未有CF在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)是否有降解的研究文獻(xiàn)，今后的試驗(yàn)可通過(guò)增加CF添加量或瘤胃保護(hù)性CF進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)結(jié)果還可能與綿羊體內(nèi)TPH表達(dá)量有關(guān)。如果TPH表達(dá)量較低，BH4已使其飽和，通過(guò)添加CF增加BH4含量也可能對(duì)TPH1活性無(wú)顯著影響。研究表明，哺乳動(dòng)物機(jī)體超過(guò)95%的5-HT分布于胃腸道，主要有腸嗜鉻細(xì)胞合成[22-23]。本試驗(yàn)中，上午飼喂后10.0 h時(shí)，試驗(yàn)組綿羊血漿5-HT含量極顯著高于對(duì)照組，這可能與添加CF促進(jìn)了腸嗜鉻細(xì)胞中TPH1的表達(dá)和5-羥色氨酸合成有關(guān)。由于本試驗(yàn)未采集綿羊腸黏膜組織，在以后試驗(yàn)中可通過(guò)測(cè)定綿羊腸黏膜中TPH1含量進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究表明，TPH1不僅是合成5-HT的限速酶，也是合成MT的關(guān)鍵酶[24]。在白天，哺乳動(dòng)物血漿MT主要來(lái)于腸嗜鉻細(xì)胞[25]。Namboodiri等[26]證實(shí)，腹腔注射20或200 mg/kg BW的5-羥色氨酸可顯著提高綿羊血漿MT含量。本試驗(yàn)中，上午飼喂后6.0和8.0 h時(shí)，試驗(yàn)組綿羊血漿MT含量有增加的趨勢(shì)，上午飼喂后10.0 h時(shí)極顯著高于對(duì)照組。這可能與添加CF增加了綿羊腸嗜鉻細(xì)胞中TPH1表達(dá)量、提高了血漿5-羥色氨酸含量有關(guān)。此外，5-HT既是色氨酸、5-羥色氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，也是生成MT的前體物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，腸嗜鉻細(xì)胞、腸神經(jīng)細(xì)胞、血小板、肝臟和腎臟廣泛存在單胺氧化酶，可將5-HT轉(zhuǎn)化為5-羥吲哚乙酸，最后經(jīng)尿液排出體外[23,27-28]。本試驗(yàn)中，上午飼喂后4.5 h時(shí)，試驗(yàn)組血漿5-HT含量有增加的趨勢(shì)，而MT含量并未增加，可能與補(bǔ)喂CF增加了綿羊體內(nèi)5-羥吲哚乙酸含量有關(guān)。在今后的研究中可進(jìn)一步檢測(cè)綿羊血漿和尿液中5-羥吲哚乙酸含量，驗(yàn)證RPTrp飼糧中添加不同劑量CF對(duì)綿羊血漿5-HT含量的影響。

3.3 RPTrp飼糧中添加CF對(duì)綿羊血漿抗氧化能力的影響

本試驗(yàn)中，RPTrp飼糧中添加CF可提高綿羊血漿抗氧化能力。研究表明，葉酸可促進(jìn)二氫生物喋呤(BH2)向BH4轉(zhuǎn)化，而BH4具有抗氧化的功能[29]。由于CF可直接提供葉酸在體內(nèi)的活化形式，促進(jìn)BH2向BH4轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)結(jié)果可能與綿羊血漿BH4含量升高有關(guān)。此外，本試驗(yàn)結(jié)果還可能與綿羊血漿MT含量升高有關(guān)，MT是一種有效的抗氧化劑，可減少機(jī)體活性氧和活性氮的含量，增加抗氧化酶的表達(dá)和活性[6]。

4 結(jié) 論

在RPTrp(222.2 mg/kg BW)飼糧中每天每只綿羊添加50或100 mg的CF，有降低血漿Kyn含量的趨勢(shì)，對(duì)白天血漿Trp、5-HT、MT含量整體沒有顯著影響，但可提高綿羊血漿抗氧化能力。