王 根 陳 暉 趙 芳 高 超 趙國棟 李曉斌 馬 晨 楊開倫

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室，烏魯木齊830052)

哺乳動物體內(nèi)褪黑素(melatonin，MT)是主要由松果體合成和分泌的一種吲哚類激素，廣泛分布在很多器官、組織和細胞中[1-2]。研究顯示，MT可促進綿羊卵母細胞成熟[3]、維持精子功能[4]、促進胚胎發(fā)育[5]和提高機體的抗氧化能力[6]，因此適當提高血漿MT含量可能對綿羊生殖和機體健康具有重要的意義。色氨酸(tryptophan，Trp)作為動物體內(nèi)合成MT的前體物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)羥化、脫羧、乙酰化和甲基化形成MT。本實驗室前期研究表明，補喂瘤胃保護性色氨酸(rumen protected tryptophan，RPTrp)可提高綿羊血漿總Trp和游離Trp含量，同時犬尿氨酸(kynurenine，Kyn)含量也升高。提高Trp轉(zhuǎn)化為MT合成量首先要提高5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)合成量，而四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)是Trp合成5-HT的關(guān)鍵酶色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)的輔酶[7]。亞葉酸鈣(calcium folinate，CF)是葉酸的衍生物，經(jīng)吸收后可直接提供葉酸在體內(nèi)的活化形式，具有穩(wěn)定BH4的作用[8-9]。因此，本試驗選擇綿羊為試驗動物，在RPTrp飼糧中添加CF，探究CF對調(diào)控反芻動物體內(nèi)MT合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2017年7月30日至2017年8月14日在新疆惠康畜牧生物科技有限公司羊場、自然光照條件下進行。采集血樣當天日出時間為07:12，日落時間為21:15，晝長14.03 h。

1.2 試驗動物

選擇(3.0±0.5)歲、平均體重(64.45±3.48) kg的健康薩?？司d羊15只。

1.3 試驗設(shè)計

將15只薩?？司d羊隨機分為3組，每組5只，分別為對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組。所有試驗羊只飼喂同一營養(yǎng)水平精料補充料(購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司)，每天每只羊精料補充料飼喂量為12 g/kg BW、RPTrp(購自北京亞禾營養(yǎng)高新技術(shù)有限公司，Trp含量≥45%，過瘤胃率≥85%)為222.2 mg/kg BW(補喂量參考Itabashi等[10]的研究結(jié)果)、玉米青貯為1.8 kg，混合干草(苜?！名溄?1∶1)為自由采食，自由飲水，在此基礎(chǔ)上，試驗Ⅰ組每天每只羊添加50 mg的CF(購自上?？戮S化學技術(shù)有限公司)，試驗Ⅱ組每天每只羊添加100 mg的CF(添加量參考Ravaud等[11]的研究結(jié)果)。精料補充料組成及營養(yǎng)水平見表1，玉米青貯、苜蓿和麥秸的營養(yǎng)水平見表2。

表1 精料補充料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克精料補充料提供 The premix provided the following per kg of the concentrate supplement：VA 480 IU，VB1816 mg，VB2333 mg，VB649 mg，VD 70 IU，VE 21 333 IU，泛酸 pantothenic acid 20 mg，煙酰胺 nicotinamide 485 mg，Cu (as copper sulfate) 11 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 35 mg，Mn (as manganese sulfate) 33 mg，Zn (as zinc sulfate) 31 mg，I (as potassium iodide) 2 mg，Se (as sodium selenite) 6 mg，Co (as cobalt chloride) 1 mg。

2)營養(yǎng)水平為實測值。Nutrient levels were measured values.

表2 玉米青貯、苜蓿干草、麥秸的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

營養(yǎng)水平為實測值。Nutrient levels were measured values.

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗羊只單欄位飼養(yǎng)，每天每只羊的RPTrp、CF、精料補充料和玉米青貯平均分成2份，分別于08:00、20:00飼喂。為保證RPTrp和CF采食完全，先將RPTrp、CF與50 g精料補充料混勻后飼喂，待綿羊采食完畢后再投喂剩余精料補充料、玉米青貯，自由采食混合干草和飲水。根據(jù)試驗羊場的飼養(yǎng)管理規(guī)定，定期打掃圈舍。

1.5 樣品的采集與處理

于試驗的第16天采集血樣，采集時間點為上午飼喂前0 h(07:30)、飼喂后1.5、3.0、4.5、6.0、8.0、10.0、12.0 h，通過頸靜脈采集血液至肝素鈉抗凝采血管中，3 500 r/min離心15 min制備血漿，分裝至1.5 mL Eppendorf管中，標記后-20 ℃冰箱中冷凍保存。

1.6 指標的測定

采用高效液相色譜法測定血漿Trp、Kyn含量[12]。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿5-HT、MT含量；上午飼喂前0 h血漿總抗氧化能力(T-AOC)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量采用比色法測定，樣品均送至北京華英生物技術(shù)研究所進行檢測。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件的ANOVA進行單因素方差分析，差異顯著則用Duncan氏法進行多重比較。用P≤0.01、P≤0.05和0.05

2 結(jié) 果

2.1 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿Trp含量的影響

由表3可知，上午飼喂后0～12.0 h期間，各組間綿羊血漿Trp含量差異均不顯著(P>0.05)，變化趨勢基本一致；在上午飼喂后6.0和8.0 h時，與對照組相比，試驗組血漿Trp含量有降低的趨勢(P=0.087 2、P=0.053 1)。

表3 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿Trp含量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant different (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant different (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿Kyn含量的影響

由表4可知，上午飼喂后0～12.0 h期間，各組綿羊血漿Kyn含量無顯著性差異(P>0.05)，其中在上午飼喂后4.5～10.0 h期間，與對照組相比，試驗組血漿Kyn含量有降低的趨勢(P=0.094 8、P=0.066 7、P=0.090 9、P=0.054 2)。

2.3 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿5-HT含量的影響

由表5可知，上午飼喂后0～8.0 h期間，與對照組相比，試驗組綿羊血漿5-HT含量均有所提高，各組間變化趨勢相似，但各組間差異不顯著(P>0.05)；其中在上午飼喂后4.5和8.0 h時，試驗組血漿5-HT含量有增加的趨勢(P=0.080 7、P=0.054 1)；在上午飼喂后10.0 h時，試驗組極顯著高于對照組(P=0.005 7)，試驗組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿Kyn含量的影響

表5 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿5-HT含量的影響

2.4 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿MT含量的影響

由表6可知，上午飼喂后0～8.0 h期間，各組間綿羊血漿MT含量差異不顯著(P>0.05)，但在上午飼喂后6.0和8.0 h時，試驗組MT含量有增加的趨勢(P=0.089 0、P=0.070 4)。上午飼喂后8.0～10.0 h期間，對照組綿羊血漿MT含量呈下降趨勢，上午飼喂后10.0 h時為白天含量最小值，而試驗組呈上升趨勢，上午飼喂后10.0 h時極顯著高于對照組(P=0.000 2)。

2.5 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿抗氧化能力的影響

由表7可知，上午飼喂前0 h，與對照組相比，試驗Ⅱ組綿羊血漿T-AOC、GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，試驗Ⅰ組T-AOC也顯著提高(P<0.05)，但試驗Ⅰ組血漿GSH-Px活性、MDA含量與對照組差異不顯著(P>0.05)。各組間血漿SOD活性無顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿Trp、Kyn含量的影響

本試驗中，上午飼喂后0～12 h期間，各組間綿羊血漿Trp含量無顯著性差異，但試驗組均低于對照組，且在上午飼喂后6.0和8.0 h時有降低的趨勢。研究顯示，CF是葉酸的衍生物，具有穩(wěn)定和促進機體BH4合成的作用[8]。本試驗結(jié)果可能與添加CF提高了綿羊體內(nèi)BH4的含量和TPH的活性、促進Trp沿5-HT途徑分解為5-羥色氨酸有關(guān)。本試驗中，上午飼喂后4.5～10.0 h期間，與對照組相比，試驗組綿羊血漿Kyn含量有降低的趨勢，與血漿Trp含量的變化趨勢基本一致。研究表明，動物體內(nèi)約95%的L-Trp在色氨酸-2,3雙加氧酶(tryptophan-2,3-dioxygenase，TDO)和吲哚胺-2,3雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)作用下生成Kyn[13]。正常生理情況下，TDO是肝內(nèi)催化Trp形成Kyn關(guān)鍵酶，活性主要受底物Trp和激素(糖皮質(zhì)激素和雌激素)水平的影響[14-15]，而IDO主要在機體受感染、炎癥或應(yīng)激時肝外組織發(fā)揮作用[16]。本試驗中，添加CF可能對綿羊肝內(nèi)TDO活性無顯著影響，血漿Kyn含量降低可能與添加CF提高了綿羊體內(nèi)TPH活性或表達量有關(guān)。

表6 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿MT含量的影響

表7 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿抗氧化能力的影響

3.2 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿5-HT、MT含量的影響

本試驗中，上午飼喂后0～8.0 h期間，試驗組綿羊血漿5-HT含量與對照組相比無顯著性升高，但在上午飼喂后4.5和8.0 h時有升高的趨勢。研究顯示，動物體內(nèi)TPH主要有2種不同基因編碼的亞型TPH1和TPH2。TPH1主要分布在腸嗜鉻細胞和松果體中，TPH2主要分布于腸神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT神經(jīng)元中[17-19]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，BH4含量并不能使TPH2飽和，因此，直接向腦室注入10 μL濃度為20 nmol/L的BH4或通過微透析灌注BH4的類似物四氫生物蝶呤二鹽酸均可顯著增加小鼠腦部組織TPH2活性和5-HT含量[20-21]。能否通過提高血漿BH4含量進而提高TPH1活性和血漿5-HT含量還未見報道。本試驗結(jié)果可能是CF添加量不足或CF在瘤胃中降解而導(dǎo)致，對TPH1活性無顯著性影響。本試驗中CF添加量是參考胃癌患者化療時口服CF量(90 mg/d)設(shè)置[11]，目前尚未有CF在反芻動物瘤胃內(nèi)是否有降解的研究文獻，今后的試驗可通過增加CF添加量或瘤胃保護性CF進一步驗證。本試驗結(jié)果還可能與綿羊體內(nèi)TPH表達量有關(guān)。如果TPH表達量較低，BH4已使其飽和，通過添加CF增加BH4含量也可能對TPH1活性無顯著影響。研究表明，哺乳動物機體超過95%的5-HT分布于胃腸道，主要有腸嗜鉻細胞合成[22-23]。本試驗中，上午飼喂后10.0 h時，試驗組綿羊血漿5-HT含量極顯著高于對照組，這可能與添加CF促進了腸嗜鉻細胞中TPH1的表達和5-羥色氨酸合成有關(guān)。由于本試驗未采集綿羊腸黏膜組織，在以后試驗中可通過測定綿羊腸黏膜中TPH1含量進一步驗證。

研究表明，TPH1不僅是合成5-HT的限速酶，也是合成MT的關(guān)鍵酶[24]。在白天，哺乳動物血漿MT主要來于腸嗜鉻細胞[25]。Namboodiri等[26]證實，腹腔注射20或200 mg/kg BW的5-羥色氨酸可顯著提高綿羊血漿MT含量。本試驗中，上午飼喂后6.0和8.0 h時，試驗組綿羊血漿MT含量有增加的趨勢，上午飼喂后10.0 h時極顯著高于對照組。這可能與添加CF增加了綿羊腸嗜鉻細胞中TPH1表達量、提高了血漿5-羥色氨酸含量有關(guān)。此外，5-HT既是色氨酸、5-羥色氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，也是生成MT的前體物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，腸嗜鉻細胞、腸神經(jīng)細胞、血小板、肝臟和腎臟廣泛存在單胺氧化酶，可將5-HT轉(zhuǎn)化為5-羥吲哚乙酸，最后經(jīng)尿液排出體外[23,27-28]。本試驗中，上午飼喂后4.5 h時，試驗組血漿5-HT含量有增加的趨勢，而MT含量并未增加，可能與補喂CF增加了綿羊體內(nèi)5-羥吲哚乙酸含量有關(guān)。在今后的研究中可進一步檢測綿羊血漿和尿液中5-羥吲哚乙酸含量，驗證RPTrp飼糧中添加不同劑量CF對綿羊血漿5-HT含量的影響。

3.3 RPTrp飼糧中添加CF對綿羊血漿抗氧化能力的影響

本試驗中，RPTrp飼糧中添加CF可提高綿羊血漿抗氧化能力。研究表明，葉酸可促進二氫生物喋呤(BH2)向BH4轉(zhuǎn)化，而BH4具有抗氧化的功能[29]。由于CF可直接提供葉酸在體內(nèi)的活化形式，促進BH2向BH4轉(zhuǎn)化。本試驗結(jié)果可能與綿羊血漿BH4含量升高有關(guān)。此外，本試驗結(jié)果還可能與綿羊血漿MT含量升高有關(guān)，MT是一種有效的抗氧化劑，可減少機體活性氧和活性氮的含量，增加抗氧化酶的表達和活性[6]。

4 結(jié) 論

在RPTrp(222.2 mg/kg BW)飼糧中每天每只綿羊添加50或100 mg的CF，有降低血漿Kyn含量的趨勢，對白天血漿Trp、5-HT、MT含量整體沒有顯著影響，但可提高綿羊血漿抗氧化能力。