金麗麗，張麗萍

(1.遼寧林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，沈陽 110101；2.遼寧省森林經(jīng)營研究所，遼寧 丹東 118300)

厚樸為木蘭屬觀花喬木，其組織培養(yǎng)處于初步探索階段。劉賢旺等以凹葉厚樸(Magnoliaofficinalisvar.pubescens)為材料進(jìn)行了組織培養(yǎng)，最適培養(yǎng)基為VB5+2,4-D 2mg/L+6-BA 1mg/L；其生長的最適培養(yǎng)基為VB5+2,4-D 1mg/L+6-BA 1.5mg/L。雖然植物的組織培養(yǎng)越來越受到眾多科學(xué)工作者的重視，但關(guān)于厚樸組培苗的獲得只停留在試驗(yàn)階段，而真正用于生產(chǎn)的實(shí)用技術(shù)還非常少。本試驗(yàn)以厚樸莖段為材料進(jìn)行了組織培養(yǎng)特性研究，試圖找出適合該品種組培快繁的方法。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

厚樸當(dāng)年生枝條。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的選取與消毒。取當(dāng)年生、生長健壯的枝條，剪去葉，切成1.0～1.5cm小段，每段至少含1個(gè)腋芽。先將切割好的植物材料在自來水龍頭下流水沖洗30min，然后再在洗滌劑溶液中浸泡5min后，用紗布扎住燒杯口(防止植物材料被沖出)，倒掉洗滌劑溶液，自來水龍頭下流水沖洗35min。清洗后在超凈工作臺上進(jìn)行表面滅菌，用0.1%的升汞(HgCl2)溶液小燒杯中浸泡15min，無菌水沖洗8次。

1.2.2 基本培養(yǎng)基篩選。將滅菌后的莖段放到滅菌濾紙上，并將其頂端和底部切掉約0.5cm(滅菌劑殺死的部分)后，再將剩余莖段切成1cm左右的小莖段，保證每個(gè)小莖段至少帶有1個(gè)腋芽，插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)接種一個(gè)培養(yǎng)物。

將無菌的莖段接到不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的空白基本培養(yǎng)基中，供篩選的基本培養(yǎng)基有MS,1/2MS,改良MS。配制基本培養(yǎng)基，白糖3%，瓊脂0.7%，光照14～16h，光照強(qiáng)度2000～2500 lx,溫度22±2℃，pH5.8。每種處理20瓶，重復(fù)3次，60d統(tǒng)計(jì)生長情況。

1.2.3 初代培養(yǎng)基篩選。以基本培養(yǎng)基、BA、IBA、GA3三個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，每瓶1株，重復(fù)3次，60d培養(yǎng)后及發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽率，篩選出最優(yōu)組合。

1.2.4 繼代培養(yǎng)。厚樸經(jīng)過無菌體系和初代培養(yǎng)后，打開盛有初代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，瓶口過火1次，用過火、冷卻的鑷子夾住分割的莖段并迅速轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基瓶中，每瓶轉(zhuǎn)接5～6個(gè)莖段，接完后瓶口過火封口。

1.2.5 生根培養(yǎng)。芽叢縱向切成單株，高度在1cm長以上的芽苗可進(jìn)行生根培養(yǎng)(不足1cm的芽苗及愈傷組織用于繼代培養(yǎng))，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑NAA，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次，30d統(tǒng)計(jì)各處理的生根率和生根數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基篩選

莖段接種60d，3種培養(yǎng)基在一定程度能夠促進(jìn)無菌莖段的生長，其中MS效果最不明顯，MS培養(yǎng)基中的莖段無明顯變化，1/2MS培養(yǎng)基葉片伸展，莖節(jié)伸長,萌生苗健壯，改良MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的莖段葉片伸展，細(xì)長，易倒。綜合考慮，選擇1/2MS基本培養(yǎng)較為合適。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑種類的篩選

以1/2MS作為初代培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素組合，篩選出適合外植體生長的激素種類。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對生長的影響

從表1中可以看出，添加6-BA，NAA，IBA都能在一定稱度上促進(jìn)莖段萌生苗的生長，葉片顏色正常，但添加GA3沒有新葉長出，在一定稱度上抑制萌生苗的生長。因此初步選擇6-BA，NAA，IBA，其中6-BA分裂素和生長素NAA，IBA組合，經(jīng)過觀察萌生苗的生長狀態(tài)，表明6-BA和NAA組合更有利于腋芽的萌發(fā)和健壯的生長。

2.3 初代培養(yǎng)基篩選

從表2中可以看出，接種90天后，外植體在各種激素配比中的生長情況有一定差別。培養(yǎng)基中添加6-BA時(shí)，外植體的平均萌動(dòng)率隨NAA濃度的增大而明顯下降，NAA濃度為1.0mg/L時(shí)，外植體平均萌動(dòng)率最低，為25%，萌動(dòng)較慢，無葉片展開，最后出現(xiàn)褐化、死亡現(xiàn)象。NAA濃度為0.2mg/L時(shí)，外植體基部產(chǎn)生白色愈傷組織，接種90d一直保持愈傷組織狀態(tài)，直至外植體枯死。NAA濃度為0.5mg/L時(shí)，外植體生長明顯，保持萌動(dòng)狀態(tài)，莖尖分化較好，每一個(gè)葉腋都有腋芽長出，且沒有愈傷組織。

表2 不同培養(yǎng)基對萌發(fā)率的影響

綜合考慮以上情況，外植體在BA 1mg/L和 NAA 0.5mg/L的組合中生長最好。

2.4 繼代培養(yǎng)

將離體初代培養(yǎng)獲得的厚樸無菌苗，剪刀和鑷子灼燒滅菌后，左手水平持種苗瓶，右手持鑷子，使種苗瓶瓶口與右手所持的鑷子在同一水平線上，將芽叢從瓶中取出，放在無菌濾紙上，用手術(shù)刀和鑷子配合對芽叢進(jìn)行分割，并把每個(gè)小枝條切割成1～1.5cm的莖段，每個(gè)莖段上至少應(yīng)帶有1個(gè)腋芽。轉(zhuǎn)入繼代誘導(dǎo)的培養(yǎng)基BA 1mg/L和NAA 0.5mg/L中，能夠獲得腋芽發(fā)生型叢生苗。

2.5 生根培養(yǎng)

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度生長素，結(jié)果見表3。

表3 不同NAA濃度對試管苗的影響

NAA是植物組織培養(yǎng)中廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)不定根的生長素，且植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度也起著決定性作用，結(jié)果表明，1.0mg/L對厚樸誘導(dǎo)試管苗生根有促進(jìn)作用，生根率達(dá)65%，生根數(shù)為8，葉色濃綠，長勢好。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用厚樸莖段為初始外植體，將離體的植物材料經(jīng)過表面滅菌接種在各種培養(yǎng)基中，建立起無菌體系，從而縮短了萌芽時(shí)間。1/2MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽質(zhì)量比例適中，能滿足植物的生長。添加過高或過低的NAA濃度對厚樸的組織培養(yǎng)中都有抑制作用。適宜初代、繼代培養(yǎng)基為1/2MS，附加BA 1.0mg/L和 NAA 0.5mg/L，生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 1.0mg/L進(jìn)行培養(yǎng)。

厚樸在外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中使用1/2MS基本培養(yǎng)基生長良好。MS和改良培養(yǎng)基，其無機(jī)鹽與離子濃度較高，尤其硝酸鹽濃度較高，含有硝態(tài)氮，無銨態(tài)氮，和碘化鉀，直接影響細(xì)胞生理生化活動(dòng)，對離子通道也有調(diào)控作用，影響各種無機(jī)鹽的吸收。1/2MS培養(yǎng)基好于MS培養(yǎng)基，主要是由于無機(jī)鹽濃度降低，增進(jìn)了植物體整體的協(xié)調(diào)發(fā)展，對低濃度硝態(tài)氮吸收要好于銨態(tài)氮的緣故。

生長素的作用主要是促進(jìn)細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)受傷的組織表面一至數(shù)層細(xì)胞恢復(fù)分裂能力，形成愈傷組織，促進(jìn)生根等。細(xì)胞分裂素有誘導(dǎo)芽的分化、促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長的作用。試驗(yàn)只是對厚樸的一個(gè)品種進(jìn)行的研究，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素濃度的比例保持在2∶1，誘導(dǎo)效果較好。在某些方面和他人也有一定的差異[3]，這可能與其基因型差異和激素濃度有關(guān)，還須進(jìn)一步研究。