張秋炎，羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，朱志鑫，黃 芳，林曉珊，謝夢婷，吳慶暉，馬葉芬

(廣東省測試分析研究所 廣東省化學危害應急檢測技術(shù)重點實驗室 廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

高尿酸血癥是以體內(nèi)嘌呤代謝紊亂、血尿酸增高為主要特征的病癥[1]，可誘發(fā)痛風、尿石癥、慢性腎病等疾病[2]，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[3]，并與肥胖、高血壓、高血糖和血脂紊亂等代謝綜合征相關(guān)[4]。高尿酸血癥主要由尿酸生成過多或排泄不足所致，因此，目前臨床上常用的尿酸調(diào)節(jié)類藥物主要有兩大類[5-8]：抑制尿酸生成的別嘌醇、奧昔嘌醇、非布司他、托匹司他等黃嘌呤氧化酶抑制劑，以及促進尿酸排泄的丙磺舒、磺吡酮、雷西納德、阿鹵芬酯等藥物。此外，氯沙坦也可以促進尿酸排泄而作為尿酸調(diào)節(jié)類藥物使用[9]。

近年來，市場上出現(xiàn)了宣稱可以治療高尿酸血癥或緩解痛風癥狀的中成藥和保健食品，而一些不法廠商為牟取暴利向其中非法添加上述尿酸調(diào)節(jié)類西藥成分，以迅速增強療效來吸引目標人群。在不知情的情況下長期使用會引起藥物毒副反應，對消費者的身體健康造成嚴重威脅，甚至危及生命，如丙磺舒和磺吡酮等藥物會引起造血功能障礙[10-11]。因此，建立中成藥和保健食品中尿酸調(diào)節(jié)類藥物的檢測方法，對打擊非法添加行為、保障消費者身體健康具有重要意義。

目前，針對中成藥和保健食品中非法添加尿酸調(diào)節(jié)類藥物的檢測方法尚未見報道。本文通過優(yōu)化樣品前處理手段和色譜-質(zhì)譜條件，首次建立了一次進樣可同時測定中成藥和保健食品中9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，這些藥物包括別嘌醇、奧昔嘌醇、非布司他、托匹司他、丙磺舒、磺吡酮、雷西納德、阿鹵芬酯和氯沙坦，化學結(jié)構(gòu)式如圖1。本法樣品處理簡便快速、成本低、靈敏度高、定性可靠、定量準確，已成功應用于日常分析檢測，可為中成藥和保健食品中非法添加尿酸調(diào)節(jié)類藥物的定性篩查及定量分析提供技術(shù)支持，為政府相關(guān)部門提高監(jiān)控水平提供科學依據(jù)和技術(shù)保障。

圖1 9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of nine uric acid regulation drugs

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 SL Series RRLC/6410B Triple Quard MS快速高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；AS 3120超聲波發(fā)生器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；賽多利斯TP-114電子天平(美國Sartorious公司)；XW-80A快速混勻器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)。甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司)；甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨(LC-MS級,美國Sigma公司)；實驗用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

9種標準品：奧昔嘌醇(Oxipurinol，純度97%)、別嘌醇(Allopurinol，純度98%)、雷西納德(Lesinurad，純度98%)和非布司他(Febuxostat，純度98%)均購自加拿大TRC公司；托匹司他(Topiroxostat，純度98.54%)購自美國MCE公司；氯沙坦(Losartan，純度99.9%)和丙磺舒(Probenecid，純度99.5%)購自中國食品藥品檢定研究院；磺吡酮(Sulfinpyrazone，純度99%)和阿鹵芬酯(Arhalofenate，簡稱MBX-102，純度99%)購自美國Sigma公司。

所用的中成藥和保健食品均為客戶委托送檢樣品。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取各標準品10.0 mg(精確至0.01 mg)至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度(奧昔嘌醇、托匹司他不能完全溶于甲醇，需加少量二甲亞砜助溶)，混勻得到1 000 mg/L的單標標準儲備液，置棕色儲液瓶中，于-20 ℃保存。臨用時，以10%乙腈或空白基質(zhì)提取液將上述標準溶液稀釋成系列混合標準溶液。

1.3 樣品前處理

固體樣品：膠囊取內(nèi)容物，片劑、丸劑、顆粒劑研磨成粉末后混勻。準確稱取均勻試樣1.0 g(精確至0.01 g)于10 mL具塞刻度試管中，加入2 mL水，渦旋1 min，加7 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取20 min，取出，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度，混勻，準確移取1 mL至10 mL具塞刻度試管中，用水稀釋至刻度，混勻，過0.22 μm濾膜后，供測定。

液體樣品：充分搖勻。準確稱取試樣1.0 g(精確至0.01 g)于100 mL具塞刻度試管中，用10%乙腈定容至刻度，振搖混勻，過0.22 μm濾膜后，供測定。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1液相色譜條件色譜柱：Agilent Poroshell 120 Bonus-RP(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)；流動相：A相為0.1%(體積分數(shù)，下同)乙酸溶液(含5 mmol/L甲酸銨)，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.50 min，0%B；1.51～8.50 min，0%～50%B；8.50～8.51 min，50%～75%B；8.51～10.00 min，75%～95%B；10.00～11.50 min，95%B；11.50～11.51 min，95%～0%B；11.51～17.00 min，0%B。流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源：ESI；掃描模式：正離子；采集方式：多反應監(jiān)測(MRM)；干燥氣(N2)溫度：350 ℃；霧化氣(N2)壓力：276 kPa(40 psi)；干燥氣(N2)流量：9.0 L/min；毛細管入口端電壓(Capillary)：5 000 V；優(yōu)化后的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的分子式、保留時間及質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Molecular formula，retention time and MS parameters of nine uric acid regulation drugs

* quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

在電噴霧離子源的正離子和負離子模式下，分別對5 mg/L的9種待測物單標標準溶液作一級質(zhì)譜全掃描分析。實驗表明，9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物在兩種電離模式下均有響應，正離子模式下可獲得[M+H]+準分子離子峰，而負離子模式下可獲得[M-H]-準分子離子峰。但在負離子模式下，奧昔嘌醇和別嘌醇的質(zhì)譜響應優(yōu)于正離子模式，且在負離子模式下為獲得較高的質(zhì)譜信號，需在流動相中加入氨水等堿性添加劑，而較高的pH值又限制了色譜柱的選擇。綜合考慮，選用正離子模式作進一步優(yōu)化，通過選擇離子監(jiān)測(SIM)優(yōu)化毛細管出口端電壓(Fragmentor)，獲得各化合物的母離子響應最佳的碰撞電壓，然后對這些母離子作子離子全掃描分析，根據(jù)歐盟2006/657/EC決議中有關(guān)質(zhì)譜分析方法必須不少于4個識別點的規(guī)定[12]，為各待測物選取質(zhì)譜響應最佳的兩個子離子作為特征碎片離子，通過MRM方式優(yōu)化碰撞能量使其響應最佳。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。最終根據(jù)色譜保留時間和兩對MRM離子對的豐度比定性鑒別各組分，以MRM定量離子對的峰面積為依據(jù)進行定量測定。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的極性跨度較大，由化學結(jié)構(gòu)式可知，別嘌醇和奧昔嘌醇的極性偏大，在反相色譜上保留極弱，而其他7種待測物的極性較適中，在反相色譜中有較好的保留。因此，應側(cè)重于選用對極性化合物有較好保留的反相色譜柱進行試驗。試驗比較了3款不同型號的色譜柱Poroshell 120 SB-C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)(色譜柱A)、XSelect?HSS T3(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)(色譜柱B)和Poroshell 120 Bonus-RP(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)(色譜柱C)的分離效果，結(jié)果表明：色譜柱A對奧昔嘌醇以及別嘌醇的分離效果較優(yōu)，但對丙磺舒、磺吡酮、阿鹵芬酯、雷西納德等的分離效果較差；色譜柱B和C均耐受100%水相環(huán)境，更適于分離極性化合物，但部分待測物在色譜柱B上的峰形拖尾。而色譜柱C對9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物尤其是別嘌醇和奧昔嘌醇均有較好的保留，且分離效果理想，峰形對稱、峰寬較窄，所以選擇Poroshell 120 Bonus-RP(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)作為本法的色譜分離柱。

2.2.2流動相的選擇流動相及其添加劑對待測物的色譜保留行為、峰形和質(zhì)譜響應均有較大影響。在選定的色譜柱上，以乙腈為有機相，分別考察了0.1%甲酸、0.1%乙酸、5 mmol/L甲酸銨、5 mmol/L乙酸銨、0.1%乙酸(含5 mmol/L甲酸銨)、0.1%甲酸(含5 mmol/L甲酸銨)、0.1%甲酸(含5 mmol/L乙酸銨)和0.1%乙酸(含5 mmol/L乙酸銨) 8種常用水相對待測物的分離情況。結(jié)果顯示，采用0.1%甲酸或0.1%乙酸作為水相時，質(zhì)譜響應明顯增強，但前者的分離度變差，而后者的保留時間延長、峰形展寬；采用5 mmol/L乙酸銨或5 mmol/L甲酸銨作為水相時，質(zhì)譜響應明顯減弱，化合物的分離效果變差。經(jīng)反復試驗，以0.1%乙酸(含5 mmol/L甲酸銨)為水相，乙腈為有機相，采用梯度洗脫，可以獲得最佳分離效果，且待測物的色譜峰拖尾明顯減少，但其質(zhì)譜靈敏度受到較大影響。綜合考慮，最終確定色譜分離條件見“1.4.1”，該條件下9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物均具有較好的質(zhì)譜響應，良好的色譜保留和色譜峰形。圖2為9種待測物混合標準溶液的MRM定量離子對色譜圖。

圖2 9種調(diào)節(jié)尿酸類藥物混合標準溶液的MRM定量離子對色譜圖
Fig.2 MRM chromatograms of nine uric acid regulation drugs mixed standard solution

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

提取溶劑的選擇在樣品預處理中顯得尤為重要，而這又取決于目標化合物的理化性質(zhì)和樣品基質(zhì)[13]。本研究涉及的9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)雖然差別較大，但在甲醇、乙腈中均具有一定的溶解度。中成藥和保健食品多為酸性基質(zhì)，且多含氨基酸和糖苷等，此類物質(zhì)極性大，易溶于甲醇和水；而乙腈極性范圍寬，對多數(shù)化合物均具有較好的溶解性和較高的提取率，對糖、脂肪、蛋白質(zhì)化合物的提取率低，且分子小，組織穿透能力強[14]。因此，本研究分別考察了甲醇、水-甲醇、乙腈和水-乙腈作為提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，以甲醇、水-甲醇作為提取溶劑，易將極性較大的物質(zhì)一并提取，造成較大的基質(zhì)干擾；用純乙腈作為提取溶劑時，部分待測物的提取回收率過低，而采用水-乙腈作為提取溶劑時，提取回收率明顯提高，且基質(zhì)影響不明顯，但將該提取液直接進樣，會影響奧昔嘌醇和別嘌醇等強極性待測物的色譜峰形，出現(xiàn)峰分叉或前延，這主要由于進樣溶液的有機相比例過高所致。因此，實驗選擇水-乙腈為提取溶劑，采用先提取后用水稀釋的方法進行樣品處理，可以得到較理想的提取效果和色譜峰形。

2.4 基質(zhì)效應的考察

與其他分析手段不同，質(zhì)譜分析尤其是電噴霧質(zhì)譜分析往往會存在基質(zhì)效應(ME)[15-16]，影響方法的靈敏度、精密度和準確度。本文采用提取后添加法對固體樣品(膠囊)及液體樣品(藥酒)進行了基質(zhì)效應評價，用10%乙腈溶液、陰性固體基質(zhì)溶液及陰性液體基質(zhì)溶液分別配制系列濃度的混合標準溶液，上機測定，考察各待測物的基質(zhì)效應(ME)。采用公式ME=B/A(B為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率，A為純?nèi)軇┡渲茦藴是€的斜率)計算ME，結(jié)果見表2。其中ME比值越接近1，說明基質(zhì)效應越小，反之亦然。由表2可知，除雷西納德的ME值偏低外，其他8種化合物ME值在0.86～1.11之間，呈弱基質(zhì)效應，為消除或補償基質(zhì)效應給定量帶來的偏差，本文采用配制空白基質(zhì)匹配標準溶液的方法繪制標準曲線。

2.5 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件下，對6個質(zhì)量濃度水平的系列混合標準溶液進行測定，以各組分的MRM定量離子對峰面積(y)為縱坐標，對應的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標繪制標準曲線，各待測物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995 7～0.999 9(見表2)。采用標準添加法測定，以定量離子對的信噪比(S/N)≥3確定待測物的檢出限(LOD)，S/N≥10確定待測物的定量下限(LOQ)，得到9種化合物的LOD為0.03～0.6 mg/kg，LOQ為0.1～2.0 mg/kg，詳見表2。

表2 9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量下限及基質(zhì)效應Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，linear ranges，LODs，LOQs and matrix effects of nine uric acid regulation drugs

y:peak area;x:mass concentration，μg/L

2.6 回收率與相對標準偏差

取陰性固體樣品(膠囊)及陰性液體樣品(藥酒)，在低、中、高3個加標水平下分別進行加標回收試驗，每個加標水平按“1.3”方法處理后平行測定6次，計算平均回收率和相對標準偏差(見表3)。結(jié)果顯示，方法的平均回收率為79.2%～108%，相對標準偏差(RSD，n=6)為1.2%～12%，具有良好的準確度和精密度，能滿足9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的測定要求。

表3 9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and RSDs of nine uric acid regulation drugs(n=6)

2.7 實際樣品的測定

采用所建方法對客戶委托送檢的12批次中成藥或保健食品(其中膠囊3批次、片劑1批次、顆粒5批次、丸劑2批次和藥酒1批次)進行測定，均未檢出本文涉及的9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物。

3 結(jié) 論

本研究首次建立了LC-MS/MS同時快速測定中成藥和保健食品中9種非法添加尿酸調(diào)節(jié)類藥物的新方法。對樣品處理手段、色譜分離條件以及質(zhì)譜采集參數(shù)進行了優(yōu)化。方法操作簡單、快速、溶劑用量少、靈敏度高、結(jié)果準確可靠，可為宣稱治療高尿酸血癥或具有抗痛風功效的中成藥和保健食品中非法添加化學藥物的監(jiān)測提供技術(shù)支持。