江 暉，廖天宇，李廣鵬，袁玲玲，耿文華

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816))

砷及砷化物是聯(lián)合國環(huán)境署確認的對人體有巨大危害的一類物質(zhì)[1]。自然環(huán)境中砷元素分布非常廣泛，其主要形態(tài)為三價砷(As(Ⅲ))、五價砷(As(Ⅴ))、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)；海產(chǎn)品中主要為砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)。一般認為，As(Ⅲ)的毒性大于As(Ⅴ)，而DMA、MMA的毒性小于無機砷，AsB和AsC通常被認為毒性較低近似無毒[2]。砷中毒包括慢性中毒和急性中毒[3]，長期攝入含微量砷的食品、飲品等會導致慢性中毒。當人體攝入70～200 mg的無機砷化合物后會引發(fā)急性中毒，主要癥狀為休克、心律不齊、身體抽搐，甚至死亡[4]。隨著我國規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展，大量含砷化合物的畜禽飼料及飼料添加劑(羅沙胂、阿散酸等)被廣泛使用，但動植物不能完全吸收，絕大部分的砷元素隨畜禽的排泄物進入水體、土壤而在環(huán)境中不斷累積，從而加大了環(huán)境污染的風險[5]。

由于不同砷形態(tài)具有不同的毒性，而傳統(tǒng)分析方法不能準確分析各類砷形態(tài)及其含量，無法準確判斷砷的毒性大小，因此砷形態(tài)分析具有重要的實際意義。高效液相色譜(HPLC)具有分離效果好、重復性高等特點，因此常與各類檢測技術聯(lián)合[6]用于砷形態(tài)的測定。而原子熒光(AFS)可測定各類無機砷與有機砷，具有選擇性好、檢出限低、檢測速度快等特點。電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)具有可同時測定多種元素、靈敏度較高、操作簡便等特點，在測定總砷及各類重金屬含量方面得到了較廣泛的應用。

目前，對于痕量和超痕量檢測的要求越來越高，樣品預處理方法的研究成為重要的研究方向。砷形態(tài)的完全提取，以及避免基體樣品污染、砷物質(zhì)的揮發(fā)和吸附，已成為當前預處理方法研究的重要方向。按照所用的試劑不同，砷的萃取方法可分為酶萃取[7]、水萃取[8]、甲醇-水萃取[9]、氯仿-甲醇-水萃取、磷酸萃取[10]等。Giral等[11]利用磷酸提取土壤中的砷形態(tài)，發(fā)現(xiàn)磷酸是一種高效、溫和的萃取劑。本文以磷酸作為萃取試劑，利用微波萃取技術萃取污泥中的砷形態(tài)，采用LC-AFS測定污泥中的砷形態(tài)及其含量，同時采用ICP-OES測定污泥中總砷含量，并對各實驗條件進行優(yōu)化，以實現(xiàn)建立快速、高效測定污泥中砷形態(tài)的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Min plus純水儀(德國Sartorius公司)，PHS-3C型pH計(上海雷磁公司)，H1850離心機(湘儀公司)，GZX-9140 MBE電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，BSA 124S電子天平(Sartorius AG)，MDS-6溫壓雙控微波消解/萃取儀(上海新儀微波化學科技有限公司)，ICAP 6300電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Thermo-Fisher Scientific Inc.)，LC-AFS 9600液相色譜原子熒光聯(lián)用儀(北京海光儀器公司)。

甲醇(色譜純，永華化學有限公司)，鹽酸(優(yōu)級純，上海凌峰化學試劑有限公司)，硝酸(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司)，磷酸(分析純，西隴化工股份有限公司)；過氧化氫、硼氫化鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；砷標準儲備液(1 000 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測量中心)；As(Ⅲ)標準液、As(Ⅴ)標準液(1 000 mg/L，北京神州科創(chuàng)生物科技有限公司)；MMA標準液(25 mg/L)、DMA標準液(50 mg/L)、AsB標準液(40 mg/L)均購于中國計量科學研究院。

1.2 樣品采集、保存與預處理

實驗污泥取自江蘇省某大型養(yǎng)殖基地沼氣池，含水量約為85%，新鮮的污泥樣品在現(xiàn)場取樣后，用塑料容器密封，置于存有冰袋的保溫盒中，運抵實驗室后于4 ℃冰箱中保存。

實驗前將新鮮的污泥樣品放在恒重的稱量瓶中，置于25 ℃烘箱中24 h后，升溫至65 ℃下恒重(兩次質(zhì)量差小于1 mg)后得到干污泥，備用。

1.3 色譜條件與儀器參數(shù)

結(jié)合文獻[12]，液相色譜(LC)條件設置為：Hamilton PRP-X100色譜柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)；載流為5%(體積分數(shù))HCl;流動相為15 mmol/L (NH4)2HPO4溶液；還原劑為5 g/L NaOH和10 g/L KBH4；進樣體積100 μL；流速1.0 mL/min。

LC-AFS配備紫外氧化系統(tǒng)，砷形態(tài)的分離使用Hamilton色譜柱(250 mm×4.1 mm)。在紫外氧化系統(tǒng)中(紫外燈功率為24 W，流路長度為30 cm，內(nèi)徑為0.8 mm)，使用流速為0.36 mL/min的20 g/L K2S2O8溶液進行砷化物的光氧化，其后與還原劑(5 g/L NaOH和10 g/L NaBH4)和載流(5%HCl)反應產(chǎn)生揮發(fā)性的砷氫化物后，采用AFS進行檢測[13-14]。

ICP-OES條件：還原劑為4 g/L NaOH和10 g/L KBH4的混合溶液；樣品提升速率為1.0 mL/min。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure

圖1 不同萃取劑對砷形態(tài)萃取回收率的影響Fig.1 Influences of different extraction reagents on extraction recoveries of arsenic species

圖2 不同pH值對砷形態(tài)保留時間的影響Fig.2 Effects of different pH values on retention time of arsenic forms

1.4 樣品前處理

1.4.1微波消解稱取0.2 g干污泥于消解容器中，加入5 mL HNO3和2 mL H2O2的混酸靜置一段時間，蓋好蓋后進行微波消解，相關程序見表1。消解結(jié)束后靜置冷卻，將溶液完全移出，用10%(體積分數(shù))HNO3定容至25 mL，利用ICP-OES測定T-As含量[15]，同時做空白對照。

1.4.2微波萃取稱取0.1 g干污泥于萃取容器中，加入萃取溶液5 mL進行微波萃取后，將萃取液以5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜，濾液待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取劑的選擇

為有效提取污泥中砷形態(tài)，并確保砷形態(tài)在萃取過程中不被破壞，萃取劑的選擇至關重要。實驗分別采用甲醇-水(體積比1∶1)混合溶液和0.25 mol/L H3PO4作為萃取劑，利用微波萃取法萃取。4種砷形態(tài)污泥樣品的加標(20 μg/g,以干污泥含量計)回收率如圖1。由圖1可知，H3PO4對砷形態(tài)的萃取回收率明顯優(yōu)于甲醇-水混合溶液，主要原因在于：砷和磷元素是同族元素,化學性質(zhì)相近；磷酸鹽與砷酸鹽的化學形態(tài)較相似，H3PO4作為萃取劑有利于砷的萃取。因此，實驗最終選擇0.25 mol/L H3PO4為萃取劑。

2.2 pH值的優(yōu)化

利用LC-AFS聯(lián)用技術測定砷形態(tài)，需使各砷形態(tài)在液相色譜中得到完全分離，才能進一步被原子熒光檢測。流動相的pH值是液相色譜分離砷形態(tài)的主要影響因素。本實驗以(NH4)2HPO4溶液為流動相，考察了50 μg/L的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA和MMA標準溶液在流動相pH值為5.0～7.5時的保留時間(圖2)。實驗發(fā)現(xiàn)，pH值對As(Ⅲ)的保留時間無顯著影響，這是因為As(Ⅲ)的pKa1=9.3，pH<9.3時，As(Ⅲ)主要是三氧化二砷化合物，與試劑反應的可能性較小，在色譜柱中幾乎無保留[16]。當pH值為5.0～7.5時，DMA的保留時間隨pH值的增大而增加；MMA的保留時間隨pH值的增大而減?。欢鳤s(Ⅴ)的保留時間隨pH值的增大出現(xiàn)先減小后增大的情況，且在pH 6.0時的保留時間最短。綜合考慮選擇最佳流動相pH值為6.0。

2.3 甲醇用量的優(yōu)化

在流動相中添加甲醇，可以改善締合分子在兩相中的分配，提高檢測信號強度；但過量的甲醇會增加流動相的黏度，從而對各砷形態(tài)的分離產(chǎn)生干擾，導致峰高降低，靈敏度下降。實驗考察了甲醇用量對砷形態(tài)分離效果的影響。結(jié)果表明，當甲醇用量為0～20 mL時，4種砷形態(tài)的信號強度與甲醇濃度呈正相關；當甲醇用量為20～40 mL時，4種砷形態(tài)的信號強度隨著甲醇濃度的增大而減少，最終選擇最佳甲醇用量為20 mL。

2.4 鹽酸載流體積分數(shù)的優(yōu)化

在LC-AFS檢測體系中，載流將液相分離得到的物質(zhì)帶入氫化物發(fā)生器，待產(chǎn)生氣態(tài)砷后進入原子熒光進行定量檢測，因此載流濃度直接影響原子熒光基線的穩(wěn)定性。載流濃度與氣態(tài)砷產(chǎn)生效率以及原子火焰的高度也有密切關系，載流中HCl的主要作用是保證氣態(tài)砷的連續(xù)產(chǎn)生、避免熒光猝滅對分析系統(tǒng)的影響，從而使整個反應平穩(wěn)、流暢。本實驗以50 μg/L As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA和MMA的標準砷溶液、10 g/L的KBH4還原劑為基礎，考察了不同體積分數(shù)(2%～12%)HCl對砷形態(tài)檢測信號強度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，As(Ⅲ)的峰高在2%～7%HCl范圍內(nèi)增幅較大，在HCl體積分數(shù)大于7%之后增幅較?。籑MA和As(Ⅴ)的信號強度在載流為5%HCl時信號強度最佳，之后隨載流體積分數(shù)的增加而減小?？紤]到較高體積分數(shù)的HCl對檢測儀器的腐蝕較大，為延長儀器的使用壽命，保持儀器穩(wěn)定性，選擇5%HCl為最佳載流。

2.5 還原劑(KBH4)質(zhì)量濃度的影響

在原子熒光檢測系統(tǒng)中，KBH4起為砷元素發(fā)生氫化反應提供新生態(tài)氫，并與酸反應生成氫氣的作用。在原子化器出口與Ar氣結(jié)合形成Ar-H2的混合火焰，從而為原子化提供能量。因此，還原劑的濃度不僅影響砷氫化物的產(chǎn)生效率，還直接關系到火焰的穩(wěn)定性[17-18]。

若還原劑濃度過低，氫化物的生成效率下降，產(chǎn)生的Ar-H2-O2原子火焰不穩(wěn)定，將造成熒光強度下降；還原劑濃度過高，則在管路中產(chǎn)生的H2較多，生成的火焰不穩(wěn)定，會造成信噪比低，基線漂移。本實驗探討了KBH4溶液質(zhì)量濃度(0～20 g/L)對砷形態(tài)峰高的影響。結(jié)果表明，當KBH4在0～10 g/L范圍時，各砷形態(tài)的峰高均隨KBH4質(zhì)量濃度的增大而增加；當KBH4質(zhì)量濃度大于10 g/L后，峰高相應減小，而DMA在KBH415 g/L時響應值達到最大，由于DMA在KBH4質(zhì)量濃度為10 g/L和15 g/L時的信號響應值差別不大，故本實驗選用10 g/L KBH4溶液作為最佳還原劑。

圖3 4種砷形態(tài)混標溶液(50 μg/L)的出峰圖Fig.3 Chromatogram of four arsenic species(50 μg/L) mixed standard

在優(yōu)化條件下，各砷形態(tài)在10 min左右得到較好的分離。圖3為4種砷形態(tài)在上述分離條件下的色譜圖。

2.6 方法性能

2.6.1標準曲線取1 mL總砷標準溶液(GSB 04-1714-2004)，用超純水定容至500 μg/L，放入4 ℃冰箱中保存。用超純水將砷標準溶液稀釋定容制備成質(zhì)量濃度為 15.625、31.25、62.5、125、250、500 μg/L的砷標準溶液各50 mL。利用ICP-OES測定總砷標準曲線，測得該范圍內(nèi)線性方程為Y=0.977X-0.213(其中Y為峰高，X為砷質(zhì)量濃度)，相關系數(shù)為0.999 4。

取各砷形態(tài)標準儲備液，用超純水按一定比例等體積稀釋制備砷形態(tài)混標溶液，其中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA混標溶液質(zhì)量濃度為0、12.5、25、50、100 μg/L，AsB為0、20、40、80、160 μg/L。使用100 μL 微量注射器以濃度從低到高的順序?qū)藴嗜芤鹤⑷隠C-AFS檢測系統(tǒng)中，在最優(yōu)實驗條件下進樣測試，得到該范圍內(nèi)各砷形態(tài)的相關系數(shù)均大于0.999。

圖4 LC-AFS有無紫外消解條件下砷的出峰差異圖Fig.4 The difference of arsenic peak by LC-AFS with or without UV digestiona：UV off;b：UV on

在AFS檢測中，所有被測砷化物須預先生成氣態(tài)的砷化合物才能被檢測。實際中，AsB等有機砷并不能直接產(chǎn)生氣態(tài)的砷氫化物，必須通過紫外消解等手段將其轉(zhuǎn)化成易產(chǎn)生簡單氣態(tài)砷化合物的形態(tài)[17]。圖4對比了有無紫外消解條件下砷的出峰差異。

由圖4可知，4種砷形態(tài)完全分離，AsB峰與As(Ⅲ)峰重疊。但在紫外氧化系統(tǒng)作用下，AsB轉(zhuǎn)化成氣態(tài)砷化合物，可通過原子熒光進行檢測。這是因為AsB無法直接與NaBH4等反應生成氣態(tài)砷氫化物,可通過As(Ⅲ)和As(Ⅲ)+AsB兩個峰的峰面積差值來表達AsB的含量。本實驗以混標中AsB質(zhì)量濃度(0、20、40、80、160 μg/L)為橫坐標，所對應的As(Ⅲ)和As(Ⅲ)+AsB兩峰的峰面積差值為縱坐標繪制標準曲線，所得線性方程為Y=3.004X+7.179，相關系數(shù)為0.999 5，說明在0～160 μg/L范圍內(nèi)線性較好。

2.6.2檢出限將總砷和各砷形態(tài)中較低濃度的標準溶液平行測定6次，以3倍基線噪聲信號強度確定樣品的檢出限。通過計算得到As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsB的儀器檢出限(以As計)分別為0.3、2.1、1.4、1.1、0.7 μg/L，總砷的儀器檢出限為0.8 μg/L。

2.6.3精密度取總砷標液和5種砷形態(tài)的混標溶液，平行測定6次考察峰強度的相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明總砷的RSD為2.6%～4.3%；As(Ⅲ)的RSD為1.6%～2.7%；DMA為1.7%～3.2%；MMA為2.1%～3.1%；As(Ⅴ)為1.8%～3.4%；AsB為2.1%～3.5%。各砷形態(tài)的RSD均較小，表明方法重復性好，精密度較高。

2.7 實際樣品的測定

利用建立的方法對采集的污泥樣品中的砷形態(tài)和總砷進行測定，設置3個平行樣，結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示污泥中均含有不同量的各類砷形態(tài)，5種砷形態(tài)的檢出量為0.6～24.6 μg/L(表2)。

表2 不同樣品中形態(tài)砷含量和總砷含量(n=3)Table 2 Content of arsenic species and T-As in different samples(n=3) (μg/L)

3 結(jié) 論

本文采用微波消解和微波萃取對污泥樣品中砷形態(tài)進行快速預處理。通過對LC-AFS聯(lián)用系統(tǒng)中的主要影響因素進行優(yōu)化，建立了污泥中As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)和AsB 5種砷形態(tài)的測定方法。同時，利用ICP-OES測定了污泥樣品中總砷含量，結(jié)果與各形態(tài)砷總量接近。本方法精密度高，樣品前處理方法便捷，為環(huán)境樣品中砷形態(tài)的分析提供了技術基礎。