楊 旸 ，閆 瓏 ，李曉森，袁 鈴，邢中方 ，劉石磊*

(1.軍事科學(xué)院防化研究院分析測試中心，北京 102205；2.國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點實驗室，北京 102205)

化學(xué)武器(CWAs)具有殺傷起效快、中毒途徑多、持續(xù)時間長和殺傷范圍廣等特點且制造原料易得，生產(chǎn)技術(shù)簡便，具有“窮國原子彈”之稱，曾在兩伊戰(zhàn)爭中被使用。1997年，國際《禁止化學(xué)武器公約》正式生效，對禁止化學(xué)武器的生產(chǎn)、使用和貯備進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定。然而隨著國內(nèi)外恐怖主義組織活動的日漸猖獗，化學(xué)武器作為一種造價低且殺傷性強(qiáng)的恐怖活動工具頻頻登上歷史舞臺，危害人類的和平與健康?；瘜W(xué)武器主要分為神經(jīng)性毒劑、糜爛性毒劑、全身中毒性毒劑、失能性毒劑和窒息性毒劑，其中，神經(jīng)性毒劑(Nerve agents，NAs)的毒性和殺傷力最強(qiáng)，種類較多、作用機(jī)理復(fù)雜、功效特殊且發(fā)揮毒性快，因此對神經(jīng)性毒劑的中毒確證一直是國內(nèi)外防化研究的重點。

神經(jīng)性毒劑屬于有機(jī)磷酸酯類化合物，對神經(jīng)組織內(nèi)的乙酰膽堿酯酶有強(qiáng)烈抑制作用，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)化學(xué)遞質(zhì)乙酰膽堿大量蓄積，并引起膽堿能神經(jīng)過度興奮，使動物或人因呼吸衰竭、循環(huán)衰竭或驚厥而死亡。神經(jīng)性毒劑中毒初期，其生物標(biāo)志物主要以毒劑原型和水解產(chǎn)物為主，這些化合物在體內(nèi)濃度高，易于監(jiān)測，是具有較好靈敏度的生物標(biāo)志物[1-3]。其中，神經(jīng)性毒劑進(jìn)入人體內(nèi)會迅速發(fā)生水解反應(yīng)，生成烷基膦酸類化合物(如表1)，并主要存在于尿液中，部分存在于血液中。由于烷基膦酸類化合物有較高的極性和沸點，使用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析時不易在進(jìn)樣口被氣化，影響其分析檢測，故需用氟類試劑對生物樣品中提取出的烷基膦酸先進(jìn)行衍生化[4-5]。

表1 典型的神經(jīng)性毒劑在人體尿液中對應(yīng)的烷基膦酸類代謝產(chǎn)物Table 1 Alkyl phosphoric acids corresponding to metabolites of nerve agents in urine

由于尿樣中代謝產(chǎn)物烷基膦酸類化合物[6]的含量很低，且生物樣品基體復(fù)雜，內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多，因此高效快速的樣品前處理方法和高靈敏度的檢測手段[7-8]是開展神經(jīng)性毒劑溯源研究的難點。目前，對尿液中烷基膦酸類化合物的檢測均基于液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)[9-10]，但該技術(shù)對于甲基膦酸等分子量小、極性強(qiáng)的膦酸類化合物，存在因色譜保留時間靠前而受到的干擾大、離子化效率低等不足，而使用GC-MS技術(shù)可對該類型化合物的檢測起到補(bǔ)充作用。烷基膦酸為強(qiáng)極性化合物，在氣相色譜柱上保留較弱，可通過衍生化處理[11-12]改善色譜保留行為。本研究采用尿液酸化[13]、固相萃取柱富集純化[14-15]、五氟芐基溴衍生等樣品前處理手段有效獲得目標(biāo)物，并建立了快速鑒定尿液中烷基膦酸類化合物的氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜方法[16]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Trace GC Ultra TSQ quantum XLS氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配自動進(jìn)樣器、CI化學(xué)源和工作站(美國賽默飛世爾公司)；電子分析天平(德國塞多利斯，萬分之一)；Eppendorf AG 22331離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

甲基膦酸(MPA，純度95%)、甲基膦酸乙酯(EMPA，純度95%)、甲基膦酸片吶基酯(PMPA，純度96%)、甲基膦酸異丙酯(IMPA，純度96%)和甲基膦酸丁酯(BMPA，純度97%)均由防化研究院四所提供；健康尿樣由中國人民解放軍301醫(yī)院提供；陽離子交換柱(Oasis 500 mg/3 mL)；陰離子交換柱(Oasis 500 mg/3 mL)；乙腈(色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司)；五氟芐基溴(PFBBr，純度99%，美國Sigma-Aldrich 公司)；甲酸(純度>98%，美國J&K公司)；乙腈(純度>98%，美國J&K公司)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1色譜條件色譜柱：DB-17MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣；恒流模式；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；不分流進(jìn)樣；柱溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至280 ℃后保持5 min。

1.2.2質(zhì)譜條件化學(xué)(CI)離子源，負(fù)離子檢測方式；溶劑延遲5.0 min；離子源溫度200 ℃；電離能量70 eV；反應(yīng)氣為甲烷，反應(yīng)氣流量1.5 mL/min；碰撞氣為氬氣，壓力為133.322 Pa；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，掃描時間均為0.05 s，質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表2 5種烷基膦酸化合物衍生產(chǎn)物的質(zhì)譜采集條件Table 2 MS parameters of 5 alkyl phosphoric acid derivatives

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取5種烷基膦酸50.0 mg置于5 mL容量瓶中，用乙腈定容，制得10.0 g/L的烷基膦酸儲備液。將儲備液用乙腈逐級稀釋成100、10、1、0.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

精密吸取100 μL上述烷基膦酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，加至10 mL人尿液中，混勻，分別獲得質(zhì)量濃度為1 000、100、10、1 μg/L的加標(biāo)尿液；另將100 μL乙腈加至10 mL人尿液中后進(jìn)行平行操作，并作為陰性對照。

配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液和加標(biāo)尿液儲存于3～5 ℃。

1.2.4樣品的處理①取加標(biāo)尿樣和空白尿樣各0.5 mL，加入約20 μL 1 mol/L鹽酸溶液，將尿樣調(diào)至pH 4.0，25 ℃靜置20 min，以16 000 r/min離心10 min，移取上清液備用。②用2 mL水活化陽離子交換柱(500 mg/3 mL)，以0.5 mL/min流速將①中制備的上清液載入并通過陽離子交換柱，用1 mL 甲酸-水(1∶100,體積比)淋洗萃取柱，合并流出液和淋洗液，用約140 μL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 10.0。③用2 mL甲醇、2 mL水依次活化陰離子交換柱(500 mg/3 mL)，以0.5 mL/min流速將②中制備的液體載入并通過陰離子交換柱，用2 mL水淋洗萃取柱并使用微弱的氮氣流吹干柱床，1 mL 甲酸-甲醇(1∶9,體積比)洗脫萃取柱，收集洗脫液。④使用微弱的氮氣流將③中得到的洗脫液吹至近干，加入1 mL乙腈復(fù)溶后，再加30 μL PFBBr和30 mg碳酸鉀，于90 ℃下衍生1 h。衍生完成后，用氮氣將衍生溶液吹干，用0.5 mL二氯甲烷復(fù)溶，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

考慮到烷基膦酸類化合物的衍生產(chǎn)物在高溫下不穩(wěn)定，存在分解后在進(jìn)樣口及色譜柱殘留等問題，實驗對色譜進(jìn)樣口溫度進(jìn)行了優(yōu)化。以甲基膦酸異丙酯為例，取10 mg/L的甲基膦酸異丙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其氟化衍生后進(jìn)行質(zhì)譜分析，測試色譜進(jìn)樣口溫度在180、200、250、280 ℃時的色譜峰強(qiáng)度。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣口溫度的升高，衍生產(chǎn)物氣化量增大，色譜峰強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，但溫度大于250 ℃時，衍生產(chǎn)物分解，并最終在進(jìn)樣口殘留，且色譜峰強(qiáng)度有所降低，所以選擇250 ℃作為最佳的進(jìn)樣口溫度。

實驗對升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化，取10 mg/L的5種混合烷基膦酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其氟化衍生后進(jìn)行質(zhì)譜分析，兼顧5種目標(biāo)物的分離度和分析時間，最終選擇20 ℃/min為優(yōu)化的梯度升溫速率。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取10 mg/L的甲基膦酸異丙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.4”步驟，采用不分流進(jìn)樣方式，化學(xué)離子源(CI)，優(yōu)化了各烷基膦酸類化合物的反應(yīng)氣流量(0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min)。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)氣流量的增大，目標(biāo)物的色譜峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但由于反應(yīng)氣流量增大后會造成基線過高，導(dǎo)致色譜峰的信噪比有所降低，所以選擇最佳反應(yīng)氣流量為1.5 mL/min。

實驗對定性離子的碰撞能量也進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，5種烷基膦酸氟化衍生產(chǎn)物的色譜響應(yīng)值隨著碰撞能量的改變而發(fā)生變化，最終選擇的最佳碰撞能量見表2。

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

因尿樣中烷基膦酸類化合物含量很低，且基質(zhì)中的含氮類化合物對檢測干擾大，所以對目標(biāo)物的富集純化尤為重要。采用固相萃取柱對烷基膦酸類化合物進(jìn)行富集，以甲基膦酸異丙酯為例，比較了硅膠柱、C8柱、HLB柱3種不同填料的固相萃取柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于烷基膦酸類化合物的極性較強(qiáng)，3種萃取柱的流出液、淋洗液、洗脫液在氟化衍生后均檢出了目標(biāo)物，且干擾較大。鑒于目標(biāo)物的極性以及尿樣中含氮類化合物的干擾，實驗將尿樣酸化使含氮類化合物成為帶正電荷的銨鹽，再用陽離子交換柱去除，合并流出液和洗脫液，混合液中的烷基膦酸類化合物被電離成陰離子后，再用陰離子交換柱進(jìn)行富集，收集洗脫液進(jìn)行氟化衍生檢測，此時獲得的目標(biāo)物色譜峰強(qiáng)度較好，干擾也較小。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限采用外標(biāo)法定量，取不同濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，得到5種烷基膦酸類化合物的線性方程。以信噪比(S/N)≥3確定方法的檢出限(LOD)，以S/N≥10確定方法的定量下限(LOQ)。各烷基膦酸化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量下限結(jié)果列于表3。結(jié)果顯示，5種烷基膦酸均在較寬的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，能夠?qū)ξ粗獦悠愤M(jìn)行準(zhǔn)確定量。且5種烷基膦酸的檢出限和定量下限基本可達(dá)到 μg/L水平，其中甲基膦酸片吶基酯由于磷手性中心而分裂成兩個色譜峰，導(dǎo)致其檢出限和定量下限在5種烷基膦酸中最高。

2.4.2精密度配制高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6次，計算各烷基膦酸類化合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，測得日內(nèi)精密度。連續(xù)測定3日，計算各烷基膦酸化合物峰面積的RSD，測得日間精密度。測定結(jié)果如表3所示。從表中可以看出，使用該方法測得的樣品的日內(nèi)和日間精密度的RSD均低于5%，說明儀器條件、衍生方法具有較高的可靠性。

2.4.3準(zhǔn)確度取空白尿樣，分別加入高(7倍LOQ)、中(5倍LOQ)、低(3倍LOQ)3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.4”方法進(jìn)行樣品處理，平行測定6次，計算各烷基膦酸化合物的加標(biāo)回收率，結(jié)果如表3所示。從表中可以看出，3個不同濃度水平的5種烷基膦混合加標(biāo)回收率為97.3%～98.9%，說明該方法有著較好的專屬性，可同時處理含有5種目標(biāo)烷基膦酸的樣品。

2.4.4重復(fù)性取空白尿樣，分別加入高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.4”方法進(jìn)行樣品處理，平行測定6次，計算各烷基膦酸化合物峰面積的RSD，結(jié)果如表3所示。從表中可見，5種烷基膦酸的重復(fù)性RSD為5.3%～10%，說明基質(zhì)對目標(biāo)物有較大干擾，導(dǎo)致檢測結(jié)果的重復(fù)性稍差。

表3 5種烷基膦酸化合物的考察結(jié)果Table 3 Analytical performance of 5 alkyl phosphoric acid derivatives

2.5 國際禁止化學(xué)武器公約組織提供的未知染毒樣本分析

按照本方法測定了國際禁止化學(xué)武器公約組織(OPCW)提供的3個尿液樣本(UA、UB、UC，空白尿液自備)。取染毒尿樣0.5 mL，按照“1.2”方法進(jìn)行樣品處理和儀器分析，在UA、UB、UC 3個尿液樣本中均檢出IMPA和MPA，其檢出質(zhì)量濃度分別為20、50、30 μg/L和25、25、25 μg/L。其中UA樣本的定性離子對色譜圖如圖1所示。

3 結(jié) 論

本文建立了人染毒尿樣中神經(jīng)性毒劑代謝產(chǎn)物烷基膦酸化合物的檢測鑒定方法，包括鹽酸酸化、離子交換柱純化、五氟芐基溴衍生等樣品制備方法，以及氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜準(zhǔn)確檢測烷基膦酸的高靈敏度和專屬性方法。應(yīng)用此方法，能夠在神經(jīng)性毒劑染毒尿樣中準(zhǔn)確檢出μg/L水平的烷基膦酸；實現(xiàn)了痕量神經(jīng)性毒劑中毒后尿樣的溯源檢測，并成功用于未知濃度神經(jīng)性毒劑染毒尿樣品的鑒定。本方法可靠性強(qiáng)、易操作且具較強(qiáng)的適用性，適用于神經(jīng)性毒劑中毒后的溯源檢測。