許 吉, 翟兆蘭, 宋湛謙, 商士斌,2, 饒小平,2*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210042； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所， 北京 100091)

小地老虎(Agrotisypsilon)，又名土蠶、切根蟲，分布于全國(guó)各地，是雜食性害蟲，食性較廣，不僅危害棉花、玉米、小麥、高粱等農(nóng)作物，而且也危害水曲柳、胡桃楸及紅松等林木幼苗[1]。目前對(duì)小地老虎主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治方法，主要農(nóng)藥種類包括菊酯類和有機(jī)磷類，但化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用不僅會(huì)污染環(huán)境，同時(shí)也容易使害蟲產(chǎn)生抗藥性[2]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)對(duì)無(wú)公害農(nóng)藥的迫切需求以及有害生物綜合治理共識(shí)的形成，昆蟲拒食劑因具有使用安全、對(duì)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越被重視，成為無(wú)公害農(nóng)藥中的重要品種[3]。昆蟲拒食劑不直接殺滅昆蟲，而是主要通過(guò)干擾昆蟲的取食行為達(dá)到保護(hù)作物的目的，因此昆蟲拒食劑的使用不會(huì)造成生態(tài)鏈的破壞[4>-5]。常見(jiàn)的昆蟲拒食劑包括萜類、生物堿、酚類、醌類、香豆素類、糖類等不同類型的化合物，主要是通過(guò)提取分離植物次生物質(zhì)來(lái)獲得，其中萜類化合物是研究最多的一類拒食劑，萜類拒食劑主要包括單萜類、倍半萜類、二萜類和三萜類[6>-10]。通過(guò)對(duì)天然產(chǎn)物中的主要成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可以大大提高其生物活性。松香是一種具有重要價(jià)值的天然萜類樹(shù)脂，是由松樹(shù)分泌的松脂經(jīng)過(guò)蒸餾分離而得，松香的主要成分是樹(shù)脂酸，樹(shù)脂酸的結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵及羧基，可以通過(guò)加成、酯化等化學(xué)反應(yīng)引入一系列的官能團(tuán)。松香具有三環(huán)二萜結(jié)構(gòu)，是生物醫(yī)藥及生物農(nóng)藥的良好起始原料[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，脫氫樅酸的酯類衍生物對(duì)粘蟲、蚜蟲等害蟲具有一定的拒食活性，松香酸離子液體衍生物對(duì)鱟蟲、赤擬谷盜蟲和谷斑皮蠹等農(nóng)作物害蟲具有較強(qiáng)的拒食效果[12>-13]。本研究以松香為原料經(jīng)Diels-Alder加成反應(yīng)合成丙烯海松酸、富馬海松酸及馬來(lái)海松酸等松香多元酸，研究了其對(duì)小地老虎的拒食活性，以期為篩選出高活性的植物源昆蟲拒食劑提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 松香多元酸制備

根據(jù)文獻(xiàn)[14～17]的方法合成及提純脫氫樅酸、丙烯海松酸、富馬海松酸和馬來(lái)海松酸。由于松香樹(shù)脂酸結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵，與不飽和酸進(jìn)行Diels-Alder加成反應(yīng)后可以得到松香多元酸。松香與丙烯酸加成產(chǎn)物為丙烯酸松香，經(jīng)過(guò)鈉鹽法重結(jié)晶可得到丙烯海松酸[15]，松香與富馬酸加成產(chǎn)物為富馬酸松香，經(jīng)過(guò)鈉鹽法重結(jié)晶得到富馬海松酸[16]，松香與馬來(lái)酸酐加成產(chǎn)物為馬來(lái)松香，馬來(lái)松香經(jīng)過(guò)溶劑重結(jié)晶可以得到馬來(lái)海松酸[17]。為了研究松香多元酸結(jié)構(gòu)變化對(duì)拒食活性的影響，將3種松香多元酸與未加成的脫氫樅酸進(jìn)行活性對(duì)比。松香多元酸及脫氧樅酸的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 松香多元酸及脫氫樅酸的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of polyacid derivatives of rosin and dehydroabietic acid

1.2 供試幼蟲和植物的培養(yǎng)

小地老虎(Agrotisypsilon)為室內(nèi)繼代人工飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度(25±1) ℃，相對(duì)濕度(75±5)%，光周期為光照16 h、黑暗8 h(L16∶D8，h∶h，下同)，培養(yǎng)10天。選擇大小整體一致的4齡初幼蟲供試。甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)為溫室人工栽培，未接觸任何化學(xué)藥劑。

1.3 樣品對(duì)小地老虎4齡幼蟲的拒食率測(cè)定

采用浸葉法進(jìn)行拒食活性的測(cè)定。用少量乙醇溶解樣品，然后用0.1%吐溫-80水溶液配成質(zhì)量濃度1.0 g/L的樣品溶液作為試驗(yàn)組測(cè)試，0.1%吐溫-80水溶液作為對(duì)照組進(jìn)行測(cè)試。將新鮮甘藍(lán)葉片洗凈、晾干，用打孔器打成直徑2.0 cm，面積為314 mm2的葉碟，分別在質(zhì)量濃度為1.0 g/L的藥液中浸泡10 s后，取出自然風(fēng)干，放入12孔養(yǎng)蟲板中，每孔1片共放10個(gè)孔(10組實(shí)驗(yàn))，分別接入1只饑餓處理4 h的生長(zhǎng)一致的4齡小地老虎幼蟲。將試蟲置于(27±1) ℃、相對(duì)濕度(75±5)%、光周期L16∶D8條件下，用浸泡處理后的葉碟對(duì)幼蟲進(jìn)行飼養(yǎng)，于24 h后將殘存的葉碟取出，用1 mm×1 mm標(biāo)準(zhǔn)方格紙分別測(cè)量試驗(yàn)組和對(duì)照組葉碟剩余面積，取平均值計(jì)算拒食率。拒食率(%)=(對(duì)照組取食面積試驗(yàn)組取食面積)/對(duì)照組取食面積×100%。

1.4 松香多元酸對(duì)小地老虎4齡幼蟲的拒食中濃度測(cè)定

將丙烯海松酸和富馬海松酸分別用0.1%吐溫-80水溶液稀釋配制成3～4個(gè)系列濃度，將制得的新鮮甘藍(lán)葉碟分別在各濃度藥液中浸泡10 s，取出自然風(fēng)干，放入12孔養(yǎng)蟲板中，每孔1片共放10個(gè)孔，分別接入饑餓處理4 h的生長(zhǎng)一致的4齡小地老虎幼蟲，每孔1頭試蟲。以0.1%吐溫-80水溶液為對(duì)照。將處理后試蟲置于(27±1) ℃、相對(duì)濕度(75±5)%、光周期L16∶D8條件下，對(duì)幼蟲進(jìn)行飼養(yǎng)，于24 h后將殘存的葉碟取出，利用1 mm × 1 mm標(biāo)準(zhǔn)方格紙分別測(cè)量試驗(yàn)組和對(duì)照組葉碟剩余面積，計(jì)算拒食率。拒食率為50%時(shí)的樣品濃度即拒食中濃度(AFC50)的計(jì)算方法參照陳立等[18]的方法，將拒食率轉(zhuǎn)化為概率值y、衍生物質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化成對(duì)數(shù)x，利用DPS v7.05軟件得到拒食率回歸方程y=ax+b，其中b表示回歸方程的截距，a表示回歸方程的斜率，并用該回歸方程計(jì)算拒食率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度，即拒食中質(zhì)量濃度(AFC50)。使用DPS v7.05處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，求得平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)，差異顯著性采用Tukey法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品對(duì)小地老虎的拒食率

松香多元酸及脫氫樅酸對(duì)小地老虎的取食面積及拒食率列于表1中，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為 1.0 g/L 的樣品對(duì)小地老虎幼蟲無(wú)致死作用。由表中數(shù)據(jù)可以看出，丙烯海松酸及富馬海松酸處理過(guò)的葉蝶中，小地老虎的取食面積大大減少，在1.0 g/L質(zhì)量濃度下拒食率分別為78.41%和79.94%，較大地抑制了幼蟲的取食；馬來(lái)海松香表現(xiàn)出微弱的拒食活性，拒食率為13.41%；而未加成的脫氫樅酸拒食率僅為0.68%，幾乎無(wú)拒食作用。由此可見(jiàn)，脫氫樅酸結(jié)構(gòu)中有一個(gè)羧基，拒食活性較弱，丙烯海松酸及富馬海松酸結(jié)構(gòu)中分別含有2個(gè)和3個(gè)羧基，具有較強(qiáng)的拒食活性，而馬來(lái)海松酸中含有一個(gè)羧基及一個(gè)酸酐結(jié)構(gòu)，拒食活性也較弱。樣品對(duì)小地老虎的取食面積標(biāo)準(zhǔn)偏差及95%置信區(qū)間(95%置信區(qū)間就是總體參數(shù)在這個(gè)范圍的可能性大概是95%,或者說(shuō)總體參數(shù)在這個(gè)范圍,但其可信程度只有95%)數(shù)據(jù)列于表2中，從表中數(shù)據(jù)可以看出，馬來(lái)海松酸對(duì)小地老虎取食面積測(cè)試結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差較大，測(cè)試結(jié)果的離散程度較大，而丙烯海松酸和富馬海松酸的標(biāo)準(zhǔn)差較小，測(cè)試結(jié)果的離散度較小，說(shuō)明丙烯海松酸和富馬海松酸的測(cè)試結(jié)果代表性更好。

表1 樣品對(duì)小地老虎的取食面積及拒食率

表2 樣品對(duì)小地老虎的標(biāo)準(zhǔn)偏差及95%置信區(qū)間

2.2 松香多元酸對(duì)小地老虎的拒食中濃度

初篩結(jié)果表明丙烯海松酸、富馬海松酸對(duì)小地老虎具有較強(qiáng)的拒食作用，因此對(duì)這2種松香多元酸進(jìn)一步研究，測(cè)定了不同質(zhì)量濃度的松香多元酸樣品對(duì)小地老虎4齡幼蟲的拒食率，進(jìn)一步計(jì)算拒食中質(zhì)量濃度(AFC50)。不同質(zhì)量濃度松香多元酸對(duì)小地老虎的拒食率列于表3中。由表3數(shù)據(jù)可見(jiàn)丙烯海松酸、富馬海松酸對(duì)小地老虎的拒食率隨著質(zhì)量濃度的增加相應(yīng)提高。丙烯海松酸、富馬海松酸對(duì)小地老虎的拒食率回歸方程分別為y1=6.29x+0.89和y2=6.20x+1.01,拒食作用相關(guān)系數(shù)及95%置信區(qū)間如下：相關(guān)系數(shù)分別為0.989 2和0.987 4，說(shuō)明2種化合物的拒食活性與質(zhì)量濃度關(guān)系密切，拒食中質(zhì)量濃度(AFC50)分別為0.04和0.06 g/L，95%置信區(qū)間分別為0.02～0.05及0.05～0.09 g/L，丙烯海松酸的拒食中質(zhì)量濃度稍低于富馬海松酸。

表3 不同質(zhì)量濃度松香多元酸對(duì)小地老虎的拒食率

目前對(duì)小地老虎的防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治方法，主要化學(xué)農(nóng)藥包括菊酯類及有機(jī)膦類，容易造成環(huán)境惡化、生態(tài)鏈破壞及害蟲產(chǎn)生抗藥性。而使用拒食劑這種環(huán)保農(nóng)藥對(duì)小地老虎的防治目前報(bào)道較少，呂敏[19]研究了從蕓香科植物白鮮根皮中分離得到的梣酮對(duì)小地老虎的拒食活性，其中梣酮具有四降三萜骨架上的呋喃環(huán)和C，D-環(huán)結(jié)構(gòu)，是研究較多的一種天然降解的檸檬苦素類似物，梣酮對(duì)2齡小地老虎幼蟲24 h時(shí)的拒食中質(zhì)量濃度(AFC50)值為13.40 g/L。Jeyasankar[20]研究表明，植物精油、桉葉油及白珠油對(duì)小地老虎有較強(qiáng)的拒食活性，2%時(shí)拒食率分別達(dá)到92.245%及87.21%，拒食中濃度在0.5%～1%之間。相比之下，丙烯海松酸及富馬海松酸對(duì)小地老虎的拒食活性比梣酮、白珠油及桉葉油的活性強(qiáng)。

松香多元酸對(duì)小地老虎4齡幼蟲具有較高拒食活性，可有效降低小地老虎的取食量，減輕其對(duì)寄主植物的危害。丙烯海松酸、富馬海松酸對(duì)小地老虎的拒食中質(zhì)量濃度較低，下一步將進(jìn)行田間試驗(yàn)，以明確其在生產(chǎn)中的實(shí)際防治效果。

3 結(jié) 論

3.1研究了松香多元酸丙烯海松酸、富馬海松酸、馬來(lái)海松酸對(duì)小地老虎(Agrotisypsilon)的拒食活性，同時(shí)與未加成的脫氫樅酸進(jìn)行活性對(duì)比。結(jié)果表明：質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)脫氫樅酸、丙烯海松酸、馬來(lái)海松酸和富馬海松酸對(duì)小地老虎的24 h拒食率分別為0.68%、 78.41%、 13.41%和79.94%。其中，丙烯海松酸及富馬海松酸對(duì)小地老虎的拒食活性較高，較大地抑制了幼蟲的取食，馬來(lái)海松酸的拒食活性較弱。

3.2研究了丙烯海松酸及富馬海松酸對(duì)小地老虎的拒食中質(zhì)量濃度(AFC50)，結(jié)果表明二者均具有較低的AFC50，AFC50分別為0.04 和0.06 g/L，其拒食活性比梣酮、白珠油及桉葉油強(qiáng)。