胡璇 葉俊釗 廖獻花 邵琮翔 李福曦 鐘碧慧

中山大學附屬第一醫(yī)院消化科（廣州 510080）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）導致慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B）的發(fā)生，是肝硬化甚至肝癌的主要病因，造成嚴重后果。乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）血清學轉換能夠改善HBV感染免疫調控，有效降低患者終末期肝病發(fā)生風險，是抗病毒治療的重要目標[1]。研究證明白細胞介素?21（interleukin?21，IL?21）及其下游效應細胞因子干擾素?γ（interferon?γ，IFN?γ）能夠有效抑制HBV復制，促進HBV感染患者抗病毒治療的結局轉歸[2-3]。患者抗病毒免疫應答反應與自身遺傳背景的相關性逐漸受到廣泛關注與探討，炎癥性細胞因子基因多態(tài)性與HBV感染患者預后轉歸的關聯(lián)尚不明確[4-5]。

本研究通過檢測接受核苷酸類似物治療的乙型肝炎患者IL?21及其受體和IFN基因特定位點基因多態(tài)性，分析它們與HBeAg血清學轉換和乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）下降幅度的關系，旨在明確特定位點基因多態(tài)性對慢性乙型肝炎療效血清學應答的影響，為患者個體化治療提供有力證據(jù)。

1 對象與方法

1.1 病例來源和診斷標準選取2015年1月至2017年12月中山大學附屬第一醫(yī)院消化內科門診就診的慢性乙型肝炎患者，根據(jù)我國《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）診斷標準[6]，符合口服核苷酸類似物抗病毒治療指征，已接受規(guī)律抗病毒治療3年以上，HBV?DNA＜100 IU/mL且剪切波彈性成像（shear wave elastography，SWE）檢測值均小于10 kPa。入選病例共200例，按照治療3年后是否發(fā)生HBeAg血清學轉換分為HBeAg血清學轉換組（轉換組）和非轉換組（對照組），其中轉換組50例，對照組150例。排除標準：（1）其他病毒感染性肝病，膽道相關疾病，遺傳代謝性肝病，自身免疫性肝病及終末期肝病等；（2）長期飲酒酗酒史（男 ＞40 g/d，女 ＞20 g/d，超過5年；或者2周內大量飲酒史，＞80 g/d）；（3）正在接受免疫調節(jié)治療或干擾素治療患者；（4）自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、甲狀腺功能亢進等；（5）藥物濫用；（6）妊娠或哺乳。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學指標空腹6～8 h無菌條件下采集靜脈血并完成以下指標檢測：血常規(guī)，常規(guī)生物化學指標包括丙氨酸轉氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、總膽紅素、白蛋白、血尿酸、血肌酐、尿素氮、空腹血糖、空腹胰島素，乙肝血清學標志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb），HBV?DNA定量，甲胎蛋白（AFP）。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（single?nucleotide poly?morphism，SNP）分型檢測HapMap數(shù)據(jù)庫中篩選IL?21、IL?21R和IFN尚未見文獻報道或已在免疫方向文獻報道較多的SNP位點，并選擇等位基因頻率＞0.05的多態(tài)性位點。最終遴選15個SNP位點（IL?21rs13143866，rs10032644，rs12505138，rs12508721，rs17005929，rs6840978，IL?21Rrs2214537，rs8057551，rs8061992，rs3093390，rs3093301，IFNA rs1831391，rs674189，IFNG rs7956688，rs2069705）采用Assay Designer 3.1軟件進行引物設計PCR反應和單堿基擴展引物。MassArray技術進行SNP分型檢測。步驟如下：美國Agena公司基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI?TOF MS）對200個樣本15個位點進行檢測，經(jīng)PCR擴增反應，產物堿性磷酸酶處理及單堿基延伸反應后，啟動MassARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀芯片點樣，MALDI?TOF質譜儀（MassARRAY Analyzer 4.0）分析點樣后的芯片，TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計學描述，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)及四分位數(shù)間距進行統(tǒng)計學描述。定量資料采用t檢驗或者非參數(shù)檢驗，定性資料采用卡方檢驗，基因頻率及基因型頻率采用卡方檢驗或者Fisher精確概率法，多元回歸分析采用相對危險度（odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）表示，哈迪-溫伯格平衡（hardy?weinberg equilibrium，HWE）檢測 采 用 SHEsis軟 件（http：//analysis.bio?x.cn/my?Analysis.php）。所有數(shù)據(jù)均使用雙側檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料共納入臨床資料完整的200例患者，其中轉換組50例，對照組150例，兩組間年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義。轉換組的HBsAg濃度水平、ALT水平和AFP水平均顯著高于對照組（P值依次為0.012、0.010、0.035，表1）。

2.2 IL?21及其受體與IFN基因多態(tài)性預測HBeAg血清學轉換分析SNP分型檢測原始結果見圖1。15個SNP位點中共發(fā)現(xiàn)7個HBeAg血清學轉換陽性關聯(lián)位點（表2），均具有群體代表性（基因型分布均符合HWE平衡，P＞0.05），分別是IL?21 rs12505138（A ＞G）等位基因A（36.0%vs.23.8%，P=0.017）及 AA基因型（14.0%vs.5.3%，P=0.045）、rs17005929（T ＞ C）等位基因T（35.0%vs.23.5%，P=0.024）、rs6840978（C＞ T）等位基因C（93.0%vs.83.9%，P=0.022）、IL?21R基因rs8057551（A ＞G）等位基因A（60.0%vs.46.0%，P=0.015）及 AA基因型（40.0%vs.22.1%，P=0.023）、rs8061992（C＞A）等位基因C（62.0%vs.47.7%，P=0.013）及CC基因型（44.0%vs.23.5%，P=0.027）、rs3093301（T＞C）TT基因型（34.0%vs.20.0%，P=0.043）和IFNA基因rs1831391（A ＞C）等位基因A（54.1%vs.41.2%，P=0.026）及AA基因型（26.5%vs.26.9%，P=0.026）在轉換組中的頻率均顯著高于對照組。其中IL?21 rs12505138，rs17005929及IFNA rs1831391尚未見文獻報道。

表1 轉換組與對照組的基線資料Tab.1 Baseline characteristics of HBeAg seroconversion group and control group

圖1 SNP分型原始結果Fig.1 The original results of SNP

2.3 HBeAg血清學轉換陽性關聯(lián)位點基因型與HBsAg下降幅度的關系200例患者中共126例繼續(xù)原抗病毒藥物治療并隨訪至第48周（轉換組42例，對照組84例）。在基線或隨訪第48周HBsAg比較發(fā)現(xiàn)，轉換組相比對照組HBsAg水平明顯更低（基線：3.25±0.62vs.3.52±0.66 Log10IU/mL，P=0.012，48周：3.06±0.79vs.3.41±0.67 Log10IU/mL，P=0.011），但基線至隨訪第48周的HBsAg下降幅度（△HBsAg）組間比較差異無統(tǒng)計學意義（0.11±0.28vs.0.11±0.20 Log10IU/mL，P=0.887）（表3）。而繼續(xù)將△HBsAg與7個陽性關聯(lián)位點基因型進行單因素和多因素分析比較發(fā)現(xiàn)，攜帶IFNA rs1831391CC基因型與HBsAg下降幅度獨立相關（β=-0.200，95%CI：-0.122～-0.008，P=0.027），其他6個陽性位點與HBsAg下降幅度差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

流行病學調查結果顯示我國普通人群HBsAg攜帶率為7%，HBV感染導致的終末期肝硬化和肝癌所占比例高達60%～80%，HBV的高度流行對家庭、社會乃至國家?guī)順O大的經(jīng)濟壓力與健康影響，造成嚴重的社會危害[7-8]。直接抗病毒藥物即核苷類似物是現(xiàn)階段慢性HBV感染患者的基本治療藥物，以往Ⅲ期臨床試驗數(shù)據(jù)提示，規(guī)律接受替諾福韋治療患者第48周HBeAg血清學轉換率為21%，恩替卡韋治療患者第96周HBeAg血清學轉換率為31%，而藥物上市后實際數(shù)據(jù)顯示接受治療患者中HBeAg血清學清除率遠未達到該比例[9-11]。

IL?21及IFN?γ是調節(jié)免疫應答過程中的重要細胞因子，其血清學水平也被證實與肝臟疾病的嚴重程度密切相關，已被認為是抑制HBV的重要分子[2，12]。一項納入395例慢性HBV感染患者、75例HBV自愈和174例健康對照的研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染患者攜帶 IL?21 rs2221903/IL?21R rs3093301 AA/CC基因型相比AA/CT或AA/TT基因型具有更高的IL?21及IgE水平，提示攜帶IL?21R rs3093301CC基因型在HBV感染中可誘導更高的IL?21及IgE水平繼而影響HBV感染免疫狀態(tài)[13]。

本研究以探討HBV感染抗病毒治療患者IL?21與IFN相關基因多態(tài)性與血清學應答的關聯(lián)為目的，通過分析規(guī)律核苷酸類似物抗病毒治療3年后實現(xiàn)HBeAg血清學轉換患者（轉換組）和尚未發(fā)生HBeAg血清學轉換患者（對照組）數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，檢測的15個SNP位點中共7個位點特定等位基因或基因型頻率在轉換組顯著高于對照組，有助于預測HBV抗病毒治療患者HBeAg血清學轉換。其中有3個位點既往未見國內外的文獻報道，分別為IL?21 rs12505138（A ＞ G）、rs17005929（T ＞ C）和IFNA rs1831391（A＞C），首次在中國漢族人群中檢測出其單核苷酸多態(tài)性，為中國HBV感染患者抗病毒治療提供了新的數(shù)據(jù)支持。此外，IL?21 rs6840978被證實是炎癥性腸病的易感位點，并指出其與潰瘍性結腸炎的發(fā)生密切相關[14]，而在HBV感染中未見相關報道，本研究結果提示攜帶rs6840978等位基因C患者相較于等位基因T患者經(jīng)抗病毒治療后發(fā)生HBeAg血清學轉換率更高（93.0%vs.83.9%，P=0.022）。IL?21R rs8057551、rs8061992僅在一項白人受試者研究中發(fā)現(xiàn)其單核苷酸多態(tài)性與骨代謝相關，為骨質疏松癥的發(fā)生提供了遺傳學依據(jù)[15]。而本研究證實轉換組中rs8057551（A＞G）等位基因A及AA基因型、rs8061992（C＞A）等位基因C及CC基因型頻率顯著高于對照組（均P＜0.05）。同時本研究發(fā)現(xiàn)IL?21R rs3093301 TT基因型相較于CC/CT在抗病毒治療中患者實現(xiàn)HBeAg血清學轉換的預測作用（34.0%vs.20.0%，P=0.043），該結果與前人報道結果一致[13]。

表2 IL?21及其受體和IFN基因HBeAg血清學轉換陽性關聯(lián)位點基因頻率及基因型分布Tab.2 Allele and genotype frequencies of HBeAg seroconversion associated SNPs in IL?21，IL?21R and IFN gene例（%）

表3 轉換組與對照組不同時期HBsAg及差值比較結果Tab.3 Comparison of HBsAg loss between HBeAg seroconversion group and control group ±s

表3 轉換組與對照組不同時期HBsAg及差值比較結果Tab.3 Comparison of HBsAg loss between HBeAg seroconversion group and control group ±s

注：△HBsAg，HBsAg下降幅度

例數(shù)42 84組別轉換組對照組P值HBsAg（Log10IU/mL）基線3.25±0.62 3.52±0.66 0.012 48周3.06±0.79 3.41±0.67 0.011△HBsAg 0.11±0.28 0.11±0.20 0.887

HBsAg清除亦是HBV感染抗病毒治療患者臨床療效和隨訪過程中重點關注的方面，持續(xù)高水平的HBsAg濃度加劇患者肝臟相關事件的發(fā)生。本研究進一步將HBeAg血清學轉換陽性關聯(lián)位點基因多態(tài)性與隨訪48周HBsAg下降幅度分析發(fā)現(xiàn)攜帶IFNA rs1831391 CC基因型與HBsAg下降幅度獨立相關，該結果為抗病毒治療患者尋找臨床治愈線索提供新的方向與思路。

本研究在中國人群檢測發(fā)現(xiàn)7個HBeAg血清學轉換陽性關聯(lián)位點，其中包括3個國內外未見報道的新發(fā)現(xiàn)位點，2個與其他疾病相關但首次發(fā)現(xiàn)與HBV感染相關的位點，均有助于預測慢性乙型肝炎療效血清學應答。本研究的不足之處有：（1）陽性位點的功能驗證有待繼續(xù)完善；（2）乙型肝炎患者治療隨訪時間尚需適當延長以進一步驗證療效。本研究為在宿主自身遺傳背景相關的IL?21及其受體和IFN特定位點SNP多態(tài)性與乙型肝炎治療中患者抗病毒免疫功能及血清學清除的關系探討方面提供了有力的證據(jù)支持，給乙型肝炎患者臨床治療領域帶來新的理念和希望。