胡萍 王芳 周星

武漢市金銀潭醫(yī)院感染性疾病科（武漢 430000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）與肝硬化、肝細(xì)胞癌發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重影響人體健康，適應(yīng)性免疫在CHB發(fā)病中起著重要作用[1]。在適應(yīng)性免疫中，輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）主要通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體而發(fā)揮作用。最先被發(fā)現(xiàn)的兩類輔助性T細(xì)胞分別為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。后繼又發(fā)現(xiàn)了其他輔助性T細(xì)胞，包括Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cell，Treg）、Th22、Th9和濾泡輔助性T細(xì)胞（follic?ular helper T cell，Tfh）。各類細(xì)胞通過分泌不同的細(xì)胞因子，參與炎癥、腫瘤及自身免疫反應(yīng)等過程[2]。CHB的發(fā)病與乙型肝炎病毒（hepatitis B vi?rus，HBV）感染后所介導(dǎo)的免疫損傷和慢性炎癥有關(guān)[3]。Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞亞群變化在CHB中的作用備受關(guān)注，但在CHB中關(guān)于Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞亞群失衡的研究尚少[4?5]。本研究通過檢測(cè)CHB患者外周血中Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞平衡及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，探討Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞平衡在CHB炎癥免疫中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2016年1月至2017年6月間，我院就診的64例CHB患者為CHB組，其中男33例，女31例，年齡（38.9±10.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）滿足《慢性乙型肝炎防治指南》[6]中CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）排除其他病毒感染、免疫相關(guān)性疾病和使用免疫調(diào)節(jié)劑導(dǎo)致肝功能障礙者；（3）無(wú)心腦血管疾??；（4）對(duì)本研究知情同意，并簽署同意書。選取同期66例健康體檢者為對(duì)照組，即NC組，其中男35例，女31例，年齡（40.1±14.6）歲。兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究征得患者同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 主要儀器與試劑恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，佛波脂、離子霉素、莫能霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。一抗、二抗均購(gòu)自美國(guó)BD公司。白細(xì)胞介素17（interleukin?17，IL?17）、白細(xì)胞介素23（interleukin?23，IL?23）、白細(xì)胞介素 4（interleu?kin?4，IL?4）、白細(xì)胞介素 10（interleukin?10，IL?10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）、γ干擾素（Interferon?γ，INF?γ）ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Th1、Th2、Th17及Treg測(cè)定采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)：500 μL全血加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，混勻。每管分別加入佛波脂20 ng/mL、離子霉素1 mg/mL、莫能霉素10 ng/mL，再次混勻。放置于37℃5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4.5 h。孵育后混勻，取出血樣每個(gè)流式管加入100 μL，共6管，每管加入3～4 mL溶血?jiǎng)?，顛倒混勻，放? min，溶解紅細(xì)胞。離心洗滌1次。每管加入胞外抗體白細(xì)胞分化抗原4（cluster of dif?ferentiation4，CD4）、白細(xì)胞分化抗原 8（cluster of differentiation8，CD8），避光4℃孵育20 min，取出后PBS洗滌1次，加入破膜劑避光孵育20 min，取出后磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffered saline，PBS）洗滌1次，Th1、Th2、Th17、Treg檢測(cè)流式管內(nèi)分別加入INF?γ、IL?4、IL?17胞內(nèi)抗體，避光孵育20 min，PBS洗滌 1次后加入 500 μL PBS后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 細(xì)胞因子檢測(cè)IL?17、IL?23、TGF?β1、IL?4、INF?γ、IL?10細(xì)胞因子采用ELISA檢測(cè)，收集外周靜脈血5 mL，經(jīng)2 500 r/min離心后收集血清，具體實(shí)驗(yàn)操作根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.3 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的測(cè)定兩組ALT、AST結(jié)果由本院檢驗(yàn)科統(tǒng)一測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，計(jì)量資料兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ALT、AST比較CHB組ALT高于NC組（P=0.031），CHB組 AST高于 NC組（P=0.026）。見表1。

表1 兩組ALT、AST比較Tab.1 Compare of ALT，AST between two groups x ± s，g/L

2.2 兩組Th1、Th2、Th17及Treg的比較外周血中Th1細(xì)胞占CD4+比例CHB組顯著高于NC組（P=0.012），Th2細(xì)胞占CD4+比例CHB組顯著低于NC組（P=0.021），Th17細(xì)胞占CD4+比例CHB組顯著高于NC組（P=0.032），Treg細(xì)胞占CD4+比例CHB組顯著低于NC組（P=0.027）；Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞比例在CHB顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 兩組IL?17、IL?23、TGF?β1、IL?4、INF?γ、IL?10的比較與NC組相比，CHB組患者外周血IL?4、IL?10濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL?17、IL?23、TGF?β1及 INF?γ濃度增高（P＜0.05）。見表3。

3 討論

CHB發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，普遍認(rèn)為其發(fā)病與宿主免疫調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致的病理?yè)p害有關(guān)。當(dāng)機(jī)體感染乙肝病毒時(shí)，細(xì)胞免疫啟動(dòng)，急性肝炎患者會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的、非特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和Th細(xì)胞反應(yīng)，而CHB患者免疫反應(yīng)較弱，甚至不能檢測(cè)到特異T細(xì)胞反應(yīng)，從而導(dǎo)致病毒感染持續(xù)存在。乙肝患者體內(nèi)存在Thl/Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的失衡，但是目前研究結(jié)論存在一定爭(zhēng)議[7?12]。有研究[10]認(rèn)為，CHB中Th2細(xì)胞表達(dá)顯著增高，也有研究稱CHB患者外周血中Th1及其所分泌的細(xì)胞因子IFN?γ較正常對(duì)照組并無(wú)顯著改變[11]。而 FENG 等[12]研究結(jié)果認(rèn)為CHB患者肝炎活動(dòng)時(shí)Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，而Th2細(xì)胞無(wú)論在CHB活動(dòng)期與非活動(dòng)期間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究顯示在CHB組中Th1占優(yōu)勢(shì)，而Th2相對(duì)減少，Th1/Th2平衡向Th1方向偏離。同時(shí)，Th1分泌的細(xì)胞因子IFN?γ，CHB組顯著高于NC組，這也與Th1/Th2平衡偏移方向一致。既往研究發(fā)現(xiàn)肝移植后HBV復(fù)發(fā)患者肝內(nèi)IFN?γ和TNF?α的產(chǎn)生與肝細(xì)胞壞死呈正相關(guān)。本研究和既往研究均證實(shí)Th1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子與肝損傷相關(guān)，而Th2與對(duì)抗病毒感染相關(guān)，Th1細(xì)胞增強(qiáng)了細(xì)胞免疫作用，同時(shí)增加了肝臟的炎癥反應(yīng)[13]。

表2 兩組Th1/Th2、Th17/Treg的表達(dá)變化Tab.2 The change of Th1/Th2，Th17/Treg between two groups±s

表2 兩組Th1/Th2、Th17/Treg的表達(dá)變化Tab.2 The change of Th1/Th2，Th17/Treg between two groups±s

注：與NC組比較，aP＜0.05

組別CHB組NC組t值P值Th1（%）17.85±1.92a 12.25±1.23 23.429 0.012 Th2（%）1.39±0.37a 2.47±0.83 16.109 0.021 Th1/Th2 6.98±2.54a 4.26±1.74 11.056 0.029 Th17（%）2.36±1.09a 1.58±0.42 9.225 0.032 Treg（%）3.39±1.23a 5.58±1.96 13.493 0.027 Th17/Treg 0.98±0.46a 0.26±0.09 3.152 0.038

表3 兩組IL?17、IL?23、TGF?β1、IL?4、INF?γ、IL?10蛋白表達(dá)Tab.3 The expression of IL?17，IL?23，TGF?β1，IL?4，INF?γ and IL?10 protein between two groups x ± s

Th17/Treg平衡失衡與CHB的疾病發(fā)展和緩解密切相關(guān)[14]，Th17細(xì)胞在HBV感染時(shí)起促炎作用，加重肝細(xì)胞損傷[15]。而Treg細(xì)胞主要存在于抑制炎癥免疫應(yīng)答過程中[16]，兩者相互抑制共同作用。研究[17]發(fā)現(xiàn)，Th17與Treg細(xì)胞在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病階段存在免疫失衡，在免疫耐受階段，Treg細(xì)胞發(fā)揮主要作用，在嚴(yán)重炎癥活動(dòng)階段，Th17細(xì)胞發(fā)揮主要作用。本研究顯示，在CHB患者外周血中Th17比例增高，Treg細(xì)胞比例降低，Th17/Treg平衡向Th17偏移，Th17釋放的促炎細(xì)胞因子IL?17、IL?23增多，促使CHB患者肝細(xì)胞炎癥加重，加重肝細(xì)胞損傷。同時(shí)CHB組的TGF?β1顯著高于NC組，該結(jié)果是由于TGF?β1可能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th17分化，TGF?β1含量在CHB組高于NC組更能說(shuō)明其可能在CHB中存在一個(gè)正向調(diào)控Th17表達(dá)的作用[18]。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，可認(rèn)為CHB患者中Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡在CHB發(fā)病中起到重要作用。兩個(gè)平衡偏移，引發(fā)其釋放的細(xì)胞因子的改變，導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)。本研究還提示，在CHB組AST、ALT均顯著高于NC組，提示Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡與肝細(xì)胞損傷、肝功能下降直接相關(guān)。

綜上，Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡可能通過其所產(chǎn)生的細(xì)胞因子改變?cè)贑HB發(fā)病中發(fā)揮作用。