高潔 王居平 朱名毅 盧露碧 李日著

1右江民族醫(yī)學院病理生理學教研室（廣西百色 533000）；2右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院心胸血管外科（廣西百色 533000）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其病死率位居我國惡性腫瘤患者的第四位，以鱗狀細胞癌最為常見[1]，死因主要為腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[2]。CD34是一種與新生血管內(nèi)皮細胞增殖有關(guān)的蛋白，常作為腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的標志物[3]，而MVD則是腫瘤血管生成的重要標志。大量研究證實，血管生成在食管癌發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極其重要的作用[4-5]。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2（metastasis?associated gene 2，MTA2）屬于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的家族成員，其在胰腺癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中表達均增強，且與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]，但有關(guān)MTA2與食管癌血管生成相關(guān)性方面的研究，在國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本研究應(yīng)用免疫組織化學法檢測ESCC組織及正常食管組織中的MTA2和CD34的表達，探討二者與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為ESCC的轉(zhuǎn)移機制及抗ESCC血管生成治療提供理論及實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集百色市右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院2013年1月至2016年12月期間手術(shù)切除的80例患者標本蠟塊，均為ESCC組織（觀察組），同時選取胃鏡檢查活檢標本中正常食管黏膜組織30例（對照組），患者術(shù)前未進行放化療等針對腫瘤的特殊治療。所有標本均由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師診斷。其中男46例，女34例，平均58歲。術(shù)后病理分期參照國際抗癌聯(lián)盟的TNM分期標準[8]：Ⅰ+Ⅱ期42例，Ⅲ+Ⅳ期38例；分化程度：低分化28例，中分化32例，高分化20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有38例，無42例；浸潤程度：T1?T235例，T3?T445例。

1.2 主要試劑濃縮型山羊抗人抗體MTA2（Santa Cruz公司，USA）；抗山羊IgG聚合物（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；鼠抗人CD34單克隆抗體及免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測MTA2和CD34表達將選取好的石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復，分別加入MTA2抗體（1∶500）、CD34抗體覆蓋切片，滴加相應(yīng)二抗，孵育后在切片上滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色，經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，用中性樹膠封片，陰性對照用PBS緩沖液。

1.3.2 結(jié)果判定MTA2陽性表達主要位于ESCC細胞核中，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，每張切片在高倍鏡（×40）下隨機選取10個不同視野進行觀察，使用雙評分法進行結(jié)果判定[9]。（1）計數(shù)陽性細胞所占比例標準：5%以下記為0分，5%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，75%以上記為4分；（2）按細胞染色程度計分：無染色的記為0分，呈淡黃色記為1分，呈棕黃色記為2分，呈棕褐色記為3分。（1）和（2）乘積評分≤ 1分記為陰性（-），2～4分記為弱陽性（+），5～7分記為中等陽性（++），≥8分記為強陽性（+++）。CD34陽性表達者血管內(nèi)皮細胞質(zhì)呈棕色或棕黃色。MVD計數(shù)方法[8]：選取高倍鏡視野（400倍）內(nèi)最高微血管密度區(qū)3個，計數(shù)微血管的數(shù)目，取平均值后算出MVD值，結(jié)果以表示。結(jié)果判定均由兩位以上高年資病理科醫(yī)生審核。

1.4 統(tǒng)計學方法采用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0對所有數(shù)據(jù)進行分析，MTA2和CD34表達的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)，定量指標采用描述，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ESCC和正常食管組織中MTA2和CD34的表達在ESCC組織中MTA2呈強陽性表達，主要表達于細胞核中，著色為棕褐色，陽性率為85%，且有較多的核分裂像（圖1A），在正常食管組織中MTA2呈陰性表達（圖1B）。ESCC組織中MVD值（41.7±1.8）顯著高于正常食管組織的MVD值（12.3± 1.1）（P＜ 0.01），見表1。

圖1 免疫組化檢測MTA2在ESCC組織和正常食管黏膜組織中的表達（×40）Fig.1 Immunohistochemical staining analysis of MTA2 expression in ESCC tissues and normal esophageal mucosa tissues（× 40）

表1 ESCC組織和正常食管黏膜組織中MTA2、CD34的表達Tab.1 The expressions of MTA2 and CD34 in ESCC tissues and nomal esophageal mucosa tissues

2.2 MTA2、CD34表達與ESCC臨床病理特征的關(guān)系本課題組前期研究結(jié)果表明，MTA2陽性表達與浸潤深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)[10]，且呈正相關(guān)，與分化程度呈負相關(guān)（r=-0.645，P＜0.05），而與患者的年齡、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）。ESCC組織中MVD與組織大小、浸潤深度、TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與患者的年齡無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

2.3 ESCC組織中MTA2表達與MVD的相關(guān)性Spearman等級相關(guān)性檢驗分析表明，在ESCC組織中，MTA2的陽性表達與MVD呈正相關(guān)（r=0.777，P＜ 0.01）。

表2 MTA2、CD34表達與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 The relationship between MTA2 and CD34 expressions and clinical pathological parameters of esophageal squamous cell carcinoma patients

3 討論

食管癌發(fā)病率、病死率正逐年升高，腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移是中晚期食管癌患者主要的死亡原因[2]。多項研究表明腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移需要形成大量的血管[3-4]，而新生的腫瘤血管可通過提供營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移的路徑誘發(fā)原發(fā)腫瘤的浸潤生長。因此，明確腫瘤血管在惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中的作用機制，尋找抗腫瘤血管生成的治療方法，已成為治療惡性腫瘤的重要策略。

MTA2是具有核小體重塑活性的組蛋白去乙?；福╪ucleosomeremodeling deacetylase，NuRD）的重要組成部分，主要通過抑制NuRD的活性來阻止基因轉(zhuǎn)錄，并通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、細胞骨架和雌激素通路等途徑促進惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]，是近年的研究熱點。國內(nèi)外研究顯示，MTA1與多種惡性腫瘤血管生成密切相關(guān)[12-14]，HIROAKI等[15]研究發(fā)現(xiàn)在ECSS組織中，MTA1與CD34的表達呈正相關(guān)，其誘導的HIF?1α/VEGF是血管生成的關(guān)鍵因子，而MTA1與MTA2均屬于MTAs家族成員，二者在蛋白結(jié)構(gòu)上有65%的同源性，提示MTA2可能具有與MTA1相似的生物學功能。本研究發(fā)現(xiàn)MTA2在ESCC組織中高表達，且MTA2在細胞核中表達越高，ESCC細胞分化程度越低，說明MTA2表達上調(diào)是促進食管癌發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ESCC組織中MTA2表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織；在TNM分期中，Ⅲ+Ⅳ期的ESCC組織中MTA2表達高于Ⅰ+Ⅱ期組織，說明MTA2作為癌基因促進ESCC細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

研究表明，新生血管形成在多種惡性腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，而MVD是評估腫瘤血管生成的金標準[16-18]。在本研究中，CD34在ESCC中呈陽性表達，ESCC組織中MVD與腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，說明MVD與ESCC浸潤與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在ESCC組織中，MTA2表達與MVD呈正相關(guān)（r=0.777，P＜0.01），MTA2表達越高的ESCC組織中MVD值也越高，提示MTA2與ESCC新生血管生成密切相關(guān)。筆者推測，MTA2可能通過誘導血管生成使ESCC細胞獲得更具侵襲性表型而增強ESCC侵襲和轉(zhuǎn)移能力，但具體機制尚不明確。下一步研究將采用RNA干擾技術(shù)特異性的下調(diào)ESCC細胞中MTA2表達，并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達MTA2，探討MTA2對ESCC細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及血管生成在以上生物學現(xiàn)象中的作用。

綜上所述，MTA2和CD34表達與ESCC侵襲和轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)，聯(lián)合檢測MTA2和CD34的表達可能為診斷ESCC轉(zhuǎn)移提供重要依據(jù)，并可能成為抗ESCC血管生成治療提供新的靶點。