周九鵬 王英霞

1西安市胸科醫(yī)院（西安 710000）；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（昆明 650000）

膽管細(xì)胞癌（CCC）占胃腸道腫瘤的3%，在原發(fā)性肝癌中位列第二[1]，目前5年生存率仍不到5%[2]。因此，有必要尋找一種腫瘤標(biāo)志物用于診斷CCC的預(yù)后，尋找可能的靶向治療。

同源異形盒D10（HOXD10）是HOX基因家族主要的調(diào)節(jié)基因的成員，直接調(diào)節(jié)器官形成和維持分化組織的功能。已證實(shí)多種腫瘤組織或細(xì)胞HOXD10表達(dá)水平明顯低于正常組織，如乳腺癌[3-4]、胃癌[5]、膠質(zhì)瘤[6]、肝細(xì)胞癌（HCC）[7]。惡性乳腺癌細(xì)胞HOXD10表達(dá)的恢復(fù)可明顯抑制細(xì)胞的遷移和增殖[3]。HOXD10表達(dá)丟失可增強(qiáng)乳腺癌的侵襲的能力[8]。然而HOXD10在CCC的表達(dá)及作用卻少有報(bào)道，本文旨在研究HOXD10在肝外膽管癌（ECC）組織中的表達(dá)及其預(yù)后意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 患者及組織樣本該研究由西安市胸科醫(yī)院、昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究回顧了1998年11月至2013年11月在上述醫(yī)院接受手術(shù)治療的174例患者的數(shù)據(jù)資料。入選標(biāo)準(zhǔn)為：組織學(xué)證實(shí)的ECC的患者，確診時(shí)無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，除皮膚癌外無(wú)惡性腫瘤史，排除術(shù)前和術(shù)后化療史及肝內(nèi)膽管癌和壺腹癌患者。

1.2 病理學(xué)評(píng)估所有病理切片均由兩位病理學(xué)專家評(píng)估，主要判斷腫瘤生長(zhǎng)方式、組織學(xué)分化、病理切緣狀態(tài)、淋巴管浸潤(rùn)情況、周圍神經(jīng)侵襲情況和淋巴結(jié)腫瘤狀態(tài)。所有患者根據(jù)第七版（AJCC）ECC的分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。

1.3 隨訪術(shù)后所有患者均接受常規(guī)臨床隨訪，包括術(shù)后每1～3個(gè)月進(jìn)行CT掃描、肝功能檢查和糖類抗原 19?9（CA19?9）檢查。評(píng)估術(shù)后生存情況：隨訪至患者死亡或研究截止日期2015年12月10日。到研究結(jié)束時(shí)，119例（68.3%）患者死亡。

1.4 免疫組織化學(xué)染色與評(píng)估組織切片（4 μm）石蠟包埋，福爾馬林固定后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：HOXD10鼠抗人單克隆抗體（1∶800；abgent公司）。免疫組化染色采用SABC法（Vectastain Elite ABC 試劑盒，Vector Laboratories，Burlingame，CA）?？乖迯?fù)：微波爐95℃ 15 min，冷卻95℃2 h，脫蠟切片用含3%過(guò)氧化氫的甲醇處理10 min。PBS清洗10 min后血清封閉?？笻OXD10單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。PBS清洗后，生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育10 min，之后過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素孵育10 min，DAPI顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。常規(guī)應(yīng)用免疫組化陽(yáng)性和陰性對(duì)照。每個(gè)切片進(jìn)行免疫反應(yīng)評(píng)分基于免疫陽(yáng)性細(xì)胞的比例（0：＜10%；1：≥ 10%～ ＜25%；2：≥ 25%～＜50%；3：≥50%～ ＜75%，4：≥75%）乘以染色強(qiáng)度（0：無(wú)著色；1：輕度；2：中度；3：強(qiáng)著色）。HOXD10表達(dá)水平分為4級(jí)：0：陰性；1～ 4：弱陽(yáng)性；5～ 8：中度陽(yáng)性；9～12：強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分類變量采用Pearson卡方檢驗(yàn)，等級(jí)變量采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。用Kaplan?Meier單因素分析法分析可能的預(yù)后因素，用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS18.0軟件。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXD10在ECC表達(dá)的免疫組化結(jié)果ECC組織HOXD10表達(dá)水平比正常癌旁組織明顯降低（P=0.001，圖1A）。HOXD10表達(dá)降低伴隨著腫瘤分化程度的降低（圖1B）。ECC組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有HOXD10表達(dá)，與以前的研究相一致（圖1C、D、E）[9-10]。

圖1 HOXD10 CCC組織中與癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of HOXD10 in CCC tissues and normal para?carcinoma tissues

2.2 HOXD10表達(dá)與ECC臨床病理特征相關(guān)性HOXD10高表達(dá)與ECC的低組織學(xué)分級(jí)（P＜0.001）和低的 T分期（P=0.002）明顯相關(guān)。HOXD10蛋白表達(dá)與其他臨床病理特征無(wú)顯著相關(guān)。見(jiàn)表1。

2.3 HOXD10表達(dá)對(duì)ECC的預(yù)后價(jià)值單因素生存分析示，與HOXD10表達(dá)陽(yáng)性的患者相比，HOXD10陰性和陽(yáng)性患者平均總生存期分別為14個(gè)月和23.7個(gè)月（P＜0.001，表2）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）、組織學(xué)分級(jí)（P=0.018）、晚的臨床分期（P＜0.001）及手術(shù)切緣（P＜0.001）可顯著影響ECC患者的預(yù)后。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析表明HOXD10蛋白表達(dá)陰性是總生存期的不良獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.002，HR=1.830，表3）。

3 討論

本研究顯示，相比正常癌旁組織，HOXD10蛋白水平在ECC組織表達(dá)下調(diào)。這與之前乳腺癌[3-4]、胃癌[5]、肝癌[7]、結(jié)腸癌[11]、甲狀腺癌[12]和前列腺癌[13]中的研究一致。在這些腫瘤中，HOXD10已被證實(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[3-7]。相反的是，口腔鱗狀細(xì)胞癌HOXD10表達(dá)明顯高于正?？谇火つ14-15]。過(guò)度的HOXD10表達(dá)在頭頸部鱗癌細(xì)胞株表現(xiàn)為促進(jìn)增殖、黏附和遷移[9]。HOXD10在人類腫瘤生長(zhǎng)中也許有不同的作用。

圖2 單因素分析顯示，與HOXD10陰性表達(dá)的患者相比，HOXD10陽(yáng)性表達(dá)的ECC患者有較長(zhǎng)的總生存期（P＜0.001）Fig.2 The analysis with Kaplan?Meier method clearly showed that ECC patients having tumors with HOXD10 positive expression had increased overall survial compared with patients with negative HOXD10 expression（P ＜ 0.001）

表1 HOXD10表達(dá)與174例ECC臨床病理特征相關(guān)性Tab.1 Association of HOXD10 expression with the clinicopathological features of 174 patients with ECC 例

表2 ECC患者預(yù)后與各種臨床病理參數(shù)的單因素分析（n=174）Tab.2 Univariate analysis of the association between prognosis and various clinicopathologic parameters in patients with ECC

表3 ECC患者預(yù)后與各種臨床病理參數(shù)的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of the association between prognosis and various clinicopathologic parameters in patients with ECC

進(jìn)一步的分析顯示，HOXD10蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、T分期有關(guān)。HOXD10表達(dá)水平隨著腫瘤分化程度的降低而降低（圖1B）。已有研究顯示HOXD10表達(dá)水平隨著乳腺腫瘤[16-17]、胃癌[18]和子宮內(nèi)膜癌[19]的組織學(xué)分化降低而降低，與本研究結(jié)果一致。WANG等[20]卻認(rèn)為HOXD10表達(dá)與胃癌分化無(wú)關(guān)，與胃癌的T分期顯著相關(guān)。本研究并未發(fā)現(xiàn)HOXD10與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及AJCC分期相關(guān)。而有研究報(bào)道，轉(zhuǎn)移性胃癌組織較無(wú)轉(zhuǎn)移性者HOXD10顯著下調(diào)[18]。原因可能是本研究納入了更多的沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的樣本。這表明局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間可能存在著不同的分子機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。

單因素分析顯示，HOXD10蛋白表達(dá)陽(yáng)性的患者相比陰性預(yù)后較好（P＜0.001，圖2）。這與之前胃癌[5]結(jié)果相似。而HOXD10表達(dá)水平并沒(méi)有影響OSCC腫瘤的生存率[15]。HOXD10對(duì)于不同的腫瘤可能具有不同的功能。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析發(fā)現(xiàn)HOXD10陽(yáng)性表達(dá)對(duì)ECC總生存期是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素，與YANG等[10]的研究一致。HOXD10表達(dá)也是胃癌[20]、前列腺癌[13]患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。這均表明HOXD10可作為ECC患者的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。

在乳腺癌中，miR?10b[21]、miR?36b[22]下調(diào)HOXD10通過(guò)Akt信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。LIN等[23]發(fā)現(xiàn)胃癌中HOXD10啟動(dòng)子甲基化率明顯增高。在HCC中，HOXD10的表達(dá)也受啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控，通過(guò)抑制ERK信號(hào)傳導(dǎo)，抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。miR?10b通過(guò)靶向HOXD10刺激RHOC的上調(diào)，促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和遷移。另外，在甲狀腺癌中[12]，BRAF突變狀態(tài)與HOXD10甲基化和表達(dá)水平有關(guān)。HOXD10的作用機(jī)制已在其他腫瘤描述。HOXD10在ECC中抑制腫瘤的機(jī)制的尚不明確，今后需進(jìn)一步的研究來(lái)闡明HOXD10對(duì)ECC的詳細(xì)作用機(jī)制。

總之，HOXD10蛋白在ECC中的表達(dá)比正常癌旁組織明顯下降，HOXD10蛋白的高表達(dá)與良性的臨床病理特征和較高的總生存期相關(guān)。因此，HOXD10可作為預(yù)測(cè)ECC惡性行為的一個(gè)指標(biāo)。