林元杰,張峻峰,康學智,鄭明岳,王春曉,吳耀持

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電針對腰椎間盤突出癥模型大鼠脊髓JAK2-STAT3信號通路的影響

林元杰,張峻峰,康學智,鄭明岳,王春曉,吳耀持

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院,上海 200233)

觀察電針對腰椎間盤突出癥大鼠的干預效應及對脊髓JAK激酶2(JAK2)-信號傳導及轉錄激活因子3(STAT3)信號通路的影響。將48只雄性SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和電針組,每組12只。采用自體髓核移植建立大鼠腰椎間盤突出模型。電針組取右側腎俞、大腸俞、環(huán)跳、陽陵泉進行電針治療。觀察各組造模前及造模后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d大鼠右側足底機械縮足痛閾值(PWT)的變化情況,并采用Western Blot法檢測各組大鼠脊髓JAK2、磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化信號傳導與轉錄因子3(p-STAT3)的表達。模型組和電針組大鼠造模后各時間點(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d)右側PWT呈下降趨勢,此后維持在相對穩(wěn)定的范圍,其造模后各時間點(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d)右側PWT與正常組和假手術組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。電針組大鼠造模后7 d至造模后16 d右側PWT與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。模型組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白表達顯著上調,與正常組和假手術組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。電針組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白表達降低,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05,＜0.01)。電針可緩解腰椎間盤突出癥大鼠神經痛,其機制可能與抑制脊髓JAK2-STAT3信號通路有關。

電針;腰椎間盤突出癥;椎間盤移位,腰;JAK激酶2;信號傳導及轉錄激活因子3;大鼠

腰椎間盤突出癥(lumbar intervertebral disc herniation, LIDH)是一種臨床常見病,具體表現為髓核突出損害腰神經根,誘導痛覺過敏、無力,分布皮節(jié)感覺異常。本病全球年發(fā)病率為7.62%,好發(fā)于25～55歲人群[1]。LIDH給社會經濟和醫(yī)療經費帶來巨大負擔,其發(fā)病機制主要是由炎癥反應和髓核機械性壓迫神經根導致[2]。針灸以中醫(yī)學基礎理論為指導,是我國最古老的治療方法之一。在2017年美國內科年鑒發(fā)表的腰痛治療指南中,美國醫(yī)師學會將針灸推薦為治療急性和慢性腰痛的一線療法[3]。JAK激酶(Janus kinase, JAK)-信號傳導及轉錄激活因子(singal transducer and activator of transcription, STAT)細胞因子刺激信號通路可調節(jié)機體炎癥反應,參與神經病理性疼痛的形成過程。在慢性縮窄性壓迫性坐骨神經損傷的神經病理性疼痛模型大鼠中,其脊髓JAK2-STAT3信號通路的相關蛋白可被激活[4-5]。本實驗擬建立自體髓核移植構建LIDH模型大鼠,探索LIDH模型大鼠的脊髓JAK2-STAT3信號通路是否激活,通過觀察電針對LIDH大鼠脊髓JAK2-STAT3信號通路相關蛋白表達的影響,以進一步探索電針治療LIDH的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只,體重為(200±20)g,由上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物實驗中心提供。動物實驗觀察室明暗各12 h,溫度控制在20～22℃,相對濕度為50%～70%,自由飲水、攝食。適應性飼養(yǎng)1周,待大鼠適應新環(huán)境且飲食、活動正常后開始實驗。所有實驗程序均經上海市第六人民醫(yī)院動物使用和管理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

JAK2、磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化信號傳導與轉錄因子3(p-STAT3)(美國Cell Signaling Technology公司);Labsystems wellscan mk3酶標儀(Labsystems, Finland);Image quant lAS超靈敏化學發(fā)光成像儀(GEHC, Switzerland);Von frey絲(美國Stoelting公司);動物實驗手術顯微鏡;顯微手術器械(上海手術器械廠);0.30 mm×25 mm無菌針灸針(固始公元醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 造模方法

采用自體髓核移植構建LIDH模型[6-7]。具體操作為,用40 mg/kg戊巴比妥行腹腔注射麻醉,取大鼠尾椎髓核共2 mg,并沿腰背部切開皮膚,鈍性分離右側L4-S2的椎旁肌肉,將右側L5下關節(jié)突、L6上關節(jié)突和L5椎板切除,暴露右側L5背根神經節(jié)及部分硬膜外腔,將尾椎髓核放置右側L5背根神經節(jié)及硬膜外腔附近,避免造成機械性壓迫,逐層縫合傷口,手術后腹腔注射10萬單位的青霉素消炎。術后3 d內,每日采用碘伏對傷口進行抗菌處理。

1.4 動物分組及處理

采用查隨機數字表法將48只大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和電針組,每組12只。

正常組采用正常飼養(yǎng),不給予任何手術處理;模型組和電針組采用自體髓核移植構建LIDH模型;假手術組除未放置髓核外,其余步驟均同模型組和電針組。

電針組術后3 d開始電針治療。取右側腎俞、大腸俞、環(huán)跳、陽陵泉穴。在安靜環(huán)境下,將大鼠放置在大鼠固定器架上固定,露出右側腰部及四肢,待大鼠安靜后,采用75%乙醇棉球進行消毒,用0.30 mm×25 mm毫針直刺10～15 mm,然后連接電針儀(腎俞、大腸俞為1組,環(huán)跳、陽陵泉為1組),采用連續(xù)波,頻率為2 Hz,強度1 mA,留針20 min。每日1次,共治療14 d。在電針組治療期間,正常組、假手術組、模型組每日均做相同的固定處理,每次20 min。

1.5 標本采集

采用40 mg/kg戊巴比妥行腹腔注射麻醉后,開胸,輸液針刺入心尖部,灌注生理鹽水,剪開右心耳,觀察灌注液血色是否變淡,待大鼠肺臟及肝臟顏色變白后,將大鼠放置于冰上,取俯臥位,迅速暴露脊髓,取出脊髓腰膨大節(jié)段,并分離右側脊髓節(jié)段后放入液氮罐速凍,最后放入-80℃冰箱保存。為觀察電針治療過程中指標蛋白的變化情況,故選取造模后9 d、16 d進行取材。其中造模后9 d為電針治療周期的一半。每個時間點各組取6只大鼠。

1.6 觀察指標

1.6.1 機械縮足痛閾值測定

將大鼠放在金屬網格板上,待大鼠安靜適應環(huán)境10～30 min后開始測定。采用up-down法測定大鼠造模前及造模后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d右后肢機械縮足痛閾值(paw withdrawal threshold, PWT)。用von Frey hair纖維絲垂直刺激大鼠右側掌跖部無毛處,von Frey hair呈“S”型,持續(xù)作用6～8 s,相鄰刺激間隔至少7 s,大鼠出現抬足或舔足行為視為陽性反應。刺激過程中,大鼠走動或受到刺激就抬足視為可疑陽性,需等大鼠安靜下來后再行測量。陽性結果為X,陰性結果為O。

1.6.2 Western blot檢測

按照20 mg組織加入150～200 mL RIPA蛋白裂解液(含PMSF蛋白酶抑制劑),采用超聲破碎儀進行研磨勻漿(以上操作均在冰上進行)。4℃下12000 rpm離心15 min,取上清液。運用BCA法測定蛋白濃度,并通過調節(jié)使各組樣品總蛋白濃度相等。選擇配制10%分離膠,取100mg樣品上樣,用彩染marker指示標準SDS- PAGE膠。積層膠90 V電泳20～30 min,至溴酚藍進入分離膠頂部;電壓調整至120 V電泳50～70 min,最后200 mA恒流轉膜90～120 min。將PVDF膜放置封閉液(5%脫脂奶粉的TBST)室溫封閉1 h后,用封閉液稀釋相應的一抗(p-STAT3采用1:1000稀釋,STAT3采用1:1000稀釋,p-JAK2采用1:1000稀釋,JAK2采用1:1000稀釋),使PVDF膜浸泡在一抗孵育液,4℃孵育過夜。PVDF膜用TBST清洗3遍,每次清洗5 min。然后孵育二抗,用封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1:1000)和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(1:1000),將PVDF膜浸泡在二抗孵育液,室溫孵育1 h。TBST清洗3遍,每次清洗5 min。在PVDF膜上加上特超敏ECL化學發(fā)光試劑,Image Quant LAS超靈敏化學發(fā)光成像儀顯示結果。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有數據采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示,采用單因素方差分析。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時間點右側PWT比較

由圖1、表1可見,各組大鼠造模前右側PWT比較,差異無統(tǒng)計學意義 (＞0.05)。假手術組大鼠造模后1 d右側PWT有所下降,與正常組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05);而假手術組大鼠造模后3 d右側PWT有所提高,與正常組比較,差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。模型組大鼠造模后1 d至造模后7 d右側PWT呈下降趨勢,此后維持在相對穩(wěn)定的范圍,其造模后各時間點(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d)右側PWT均顯著低于正常組和假手術組,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。電針組大鼠造模后1 d至造模后5 d右側PWT呈下降趨勢,但與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05);而電針組大鼠造模后7 d至造模后16 d右側PWT則呈上升趨勢,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05);電針組大鼠造模后各時間點(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d)右側PWT與正常組和假手術組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

表1 各組大鼠不同時間點右側PWT比較 (±s,g)

注:與正常組比較1)＜0.05;與假手術組比較2)＜0.05;與模型組比較3)＜0.05

2.2 各組大鼠造模后9 d和16 d脊髓JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較

注:與正常組比較1)P＜0.01;與假手術組比較2)P＜0.01;與模型組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05

注:與正常組比較1)P＜0.01;與假手術組比較2)P＜0.01;與模型組比較3)P＜0.01

由圖2、圖3可見,各組造模后9 d和16 d JAK2、STAT3蛋白含量比較,差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。正常組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白含量與假手術組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。模型組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白表達顯著上調,與正常組和假手術組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。電針組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白表達降低,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05,＜0.01)。

3 討論

目前,髓核的生化因素在LIDH發(fā)病機制中的作用已日益受到重視。椎間盤髓核含有較多非特異性致炎物,如白介素6、前列腺素E2、白介素1a,可產生炎癥性疼痛[8-9]。自體髓核移植構建LIDH模型,其髓核內的炎性物質可引起炎癥反應,將外周傷害性信息傳入脊髓中樞,促進脊髓釋放炎性細胞因子[10]。該模型具有創(chuàng)傷小,不易感染,可重復性強等優(yōu)點。

LIDH屬于中醫(yī)學“腰腿痛”范疇。賈紅玲等[11]應用數據挖掘技術對近10年來針灸治療LIDH的腧穴使用情況進行分析,結果發(fā)現所選腧穴主要以膀胱經和膽經為主。本實驗選取膀胱經的腎俞、大腸俞和膽經的環(huán)跳、陽陵泉進行治療。環(huán)跳為疏通下肢少陽、太陽經氣之要穴;陽陵泉為八會穴之筋會,主治下肢經筋病癥要穴,環(huán)跳、陽陵泉配用可疏通經絡;腎俞、大腸俞均為局部取穴,可刺激穴位促進神經及血管功能,改善局部血液循環(huán),減輕神經疼痛癥狀[12]。研究表明,多次重復針刺具有累積效應,其療效隨著治療次數的增加而明顯提升[13]。本實驗結果表明,從造模后7 d(電針治療5次)治療結束后開始,電針組大鼠右側PWT明顯高于模型組,且隨著治療次數的增加,電針組大鼠右側PWT也隨之明顯提高。

JAK-STAT信號通路可參與細胞分化、增殖、凋亡及免疫調節(jié)。激活JAK-STAT信號通路,主要通過調控相關靶點的磷酸化水平[14-15]。JAK-STAT信號通路激活后,可引起目的基因表達,釋放一氧化氮、花生四烯酸、前列腺素、興奮性氨基酸等物質[16]。本實驗Western Blot分析結果顯示,模型組造模后9 d和16 d脊髓p-JAK2、p-STAT3的蛋白含量明顯升高,表明自體髓核可激活脊髓JAK2-STAT3信號通路。

李軍軍[5]對2型糖尿病周圍神經痛大鼠的環(huán)跳、陽陵泉給予2 Hz/1 mA的電針治療后,可改善大鼠痛敏,其脊髓p-JAK2、p-STAT3的蛋白水平表達明顯降低,表明電針可能是通過抑制脊髓JAK2-STAT3信號通路來減輕2型糖尿病周圍神經痛大鼠的癥狀。本實驗對LIDH模型大鼠右側腎俞、大腸俞、環(huán)跳、陽陵泉給予2 Hz/1 mA的電針治療,Western blot分析結果顯示電針組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白含量明顯降低,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05,＜0.01),說明電針治療LIDH的作用機制可能與抑制脊髓JAK2-STAT3信號通路有關。

綜上所述,本研究表明電針可提高LIDH模型大鼠的痛閾,減輕神經痛;同時,電針可降低脊髓p-JAK2、p-STAT3蛋白含量,故筆者推測電針治療LIDH的機制可能與抑制JAK2-STAT3信號通路有關,針對JAK2-STAT3信號通路的調控今后可能成為治療LIDH的新靶點。然而,本實驗的觀察樣本量較小,觀察的時間點相對較短,今后研究可增大樣本量,延長治療周期,還可采用JAK2-STAT3信號通路的抑制劑進行干預,從而深入探索電針的治療機制。

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Effect of Electroacupuncture on Spinal JAK2-STAT3 Pathway in a Rat Model of Lumbar Intervertebral Disc Herniation

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,200233,

To observe the intervention effect of electroacupuncture in rats with lumbar intervertebral disc herniation (LIDH) and its effect on spinal Janus kinase 2 (JAK2)-signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) pathway.Forty-eight male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a normal group, a sham operation group, a model group and an electroacupuncture group, with 12 rats in each group. Autologous nucleus pulposus transplantation was adopted to prepare the rat model of LIDH. The electroacupuncture group was intervened by electroacupuncture at Shenshu (BL23), Dachangshu (BL25), Huantiao (GB30) and Yanglingquan (GB34) on the right side. The right plantar mechanical paw withdrawal threshold (PWT) of rats in all groups was observed before modeling and 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 16 days after modeling. The expression of JAK2, phosphorylated JAK2 (p-JAK2), STAT3 and phosphorylated STAT3 (p-STAT3) in rat’s spinal cord were examined by using Western blotting method.The right PWT at different time points (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 16 days after modeling) in the model group and electroacupuncture group showed a downward trend, and then remained in a relatively stable range. The right PWTs at different time points (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 16 days after modeling) in the model group and electroacupuncture group were significantly different from those in the normal group and sham operation group (＜0.05). The right PWTs at different time points (from day 7 till day 16 after modeling) in the electroacupuncture group were significantly different from those in the model group (＜0.05). Compared with the normal group and sham operation group, the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 proteins were significantly up-regulated at different time points (9 and 16 days after modeling) in the model group(＜0.01). Compared with the model group, the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 proteins decreased significantly at different time points (9 and 16 days after modeling) in the electroacupuncture group(＜0.05,＜0.01).Electroacupuncture can relieve neuralgia of LIDH rats, and the action mechanism is possibly related to the inhibition of spinal JAK2-STAT3 pathway.

Electroacupuncture; Lumbar disc intervertebral herniation; Intervertebral disc displacement, Lumbar; Janus kinase 2; Signal transducer and activator of transcription 3; Rats

1005-0957(2018)10-1207-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.10.1207

2018-06-03

上海市科學技術委員會科研計劃項目(16401933900)

林元杰(1990—),男,2015級碩士生,Email:1034238903@qq.com

吳耀持(1961—),男,教授,博士生導師,Email:18930177222@163.com