施路一，鞠丹，楊嬌，那春子，任夢非

(黑龍江省野生動物研究所，黑龍江 哈爾濱 150081)

病原體感染通常是細(xì)菌性傳染病暴發(fā)的主要原因[1]，相同種屬的不同病原個體可能具有相同的毒力因子、生化特征及基因組特征，表明病原體間存在共同的進(jìn)化源頭，被稱為流行病學(xué)相關(guān)菌株(epidemiologically)。分型技術(shù)是利用該特征對病原個體溯源，確定傳播來源、流行范圍，為防治措施提供信息。雞致病性大腸桿菌作為一種條件性致病菌寄生于宿主雞體內(nèi)，當(dāng)某些條件成熟時，導(dǎo)致雞大腸桿菌病暴發(fā)。雞致病性大腸桿菌與非致病性大腸桿菌無法嚴(yán)格區(qū)分。研究表明O型雞大腸桿菌是主要的APEC血清型。O1、O2和O78等血清型雞大腸桿菌常表現(xiàn)高致病力。在大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群中，B2和D系統(tǒng)進(jìn)化群雞大腸桿菌往往具有高致病力。本研究在此基礎(chǔ)上以哈爾濱地區(qū)健康雞為研究對象，采集泄殖腔拭子，對分離到的雞大腸桿菌的血清型和系統(tǒng)進(jìn)化分群進(jìn)行分析，旨在明確哈爾濱地區(qū)雞大腸桿菌的流行情況，嘗試為雞大腸桿菌病流行形勢提供預(yù)警，并依此為基礎(chǔ)，為養(yǎng)殖提供經(jīng)驗。

1 材料

伊紅美藍(lán)平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯、普通瓊脂斜面參考文獻(xiàn)[2]制備。158種大腸桿菌血清型鑒定用O型血清型，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。并按說明書保存并使用。在哈爾濱市地區(qū)7家集約化養(yǎng)雞場，采集健康雞泄殖腔拭子276個，將樣品拭子于4℃條件下保存，準(zhǔn)備實驗。

2 方法

2.1 大腸桿菌的分離 取菌株樣品采集拭子接種于伊紅美藍(lán)平板培養(yǎng)基，37℃過夜；挑取特征菌落接種于麥康凱平板培養(yǎng)基，37℃過夜；挑取特征菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，取增菌物與50%甘油作等比例均勻混合后-80℃保存[3]。

2.2 革蘭氏染色鏡檢 用接種環(huán)挑取生理鹽水，與適量細(xì)菌純培養(yǎng)物混合，自然干燥后用火焰固定，草酸銨結(jié)晶紫染色2min后水洗，加盧戈碘液媒染1min后水洗，加95%酒精脫色30s后水洗，最后加番紅復(fù)染液復(fù)染1min后水洗，自然干燥后鏡檢。

2.3 生化試驗 用接種針挑取疑似大腸桿菌分離株穿刺接種并涂布三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后觀察培養(yǎng)基斜面和底部顏色變化以及產(chǎn)氣情況。按文獻(xiàn)[4]報道方法對所有分離株進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、側(cè)金盞花醇、吲哚、M.R、VP、枸櫞酸鹽 10項生化指標(biāo)的測定，以及淀粉酶試驗、木糖、甘露糖、產(chǎn)硫化氫試驗、尿素酶試驗、觸酶試驗、運動性試驗。

2.4 血清型鑒定 挑起菌株接種于普通瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)，24h后用0.5%石炭酸生理鹽水洗下，形成濃縮菌液，121℃、2h，制備菌體抗原，按血清型鑒定試劑盒說明書進(jìn)行平板凝集試驗，鑒定血清型，將定型大腸桿菌凍干保存[3-4]。

2.5 大腸桿菌分離株系統(tǒng)進(jìn)化群試驗 參考文獻(xiàn)[5]合成chuA、yiaA和DNA片段TspE4.C2的核酸序列，見表1。

表1 TspE4.C2的核酸序列

參考文獻(xiàn)[6]三重PCR方法對各菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定，見表2。

表2 三重PCR方法對各菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定

PCR 參 數(shù) 如 下 ：95℃4min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，30 個循環(huán)；72℃延伸 10min。 按 Clermont方法分析菌株分群，見圖1。

圖1 Clermont方法分析大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群

3 結(jié)果與分析

3.1 雞大腸桿菌的分離鑒定結(jié)果 在哈爾濱健康雞群中共分離得到257株大腸桿菌。

分離株在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈紫黑色，在麥康凱培養(yǎng)基上呈桃紅色，符合大腸桿菌特征，鏡檢可見革蘭氏陰性、兩端鈍圓小桿菌，散在或成對出現(xiàn)，無其他形態(tài)菌，初步鑒定為大腸桿菌純培養(yǎng)物。生化試驗鑒定，257個泄殖腔拭子樣品分離株均符合大腸桿菌特征。

3.2 血清型鑒定 分離到雞大腸桿菌有257株，定型220株，未定型26株，自凝 11株，共分為39個血清型，優(yōu)勢型為O8。與文獻(xiàn)[7]報道較一致。其中 4.1%為 O2型，是僅次于 O8、O6、O17和 O46，具有提示意義。

雞大腸桿菌鑒定結(jié)果見表3和表4。

表3 雞大腸桿菌鑒定結(jié)果

表4 220株雞大腸桿菌的O血清型

3.3 大腸桿菌分離株系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果 對220株雞大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分群試驗，PCR結(jié)果見圖2。

圖2 chuA、yiaA、TspE4.C2基因的擴增結(jié)果

參考文獻(xiàn)[4]分群方法，220株雞大腸桿菌進(jìn)化群分群情況見表5。

系統(tǒng)進(jìn)化分群認(rèn)為，A和B1群屬于共生菌，少見致病性。B2群和D群致病力較高。

結(jié)果表明共有30個血清型屬于B2群和D群，占全部血清型的76.9%。在菌株方面，屬于B2群和D群的菌株共有58株，占全部菌株的26.37%。

表5 220株雞大腸桿菌進(jìn)化群分群情況

4 討論

目前致病性雞大腸桿菌與非致病性雞大腸桿菌無法嚴(yán)格區(qū)分。O型雞大腸桿菌是主要的雞致病性大腸桿菌[8]，常見血清型有 O1、O2、O35和O78等。遼寧省 APEC流行血清型為 O78、O57、O2、O1、O35、O157 和 O8[9]。山東省 APEC 優(yōu)勢血清型為O2、O35和O78[10]。本研究從健康雞群中分離到257株大腸桿菌，除37株未確定血清型以及自凝外，共覆蓋39種血清型，O8血清型占優(yōu)勢，其余 占 比 較 多 的 血 清 型 還 有 O6、O17、O46、O2、O161、O154、O9、O15、O20、O91 等。其中 O2 血清型是重要的致病性雞大腸桿菌，該結(jié)果說明致病性雞大腸桿菌可分布于健康雞群。在本次研究中暫未對各血清型菌株致病力進(jìn)行檢測，但是在健康雞群中分離得到的血清型眾多，是引發(fā)雞大腸桿菌病暴發(fā)的潛在威脅。

大腸桿菌種群依據(jù)chuA、yjaA基因和TspE4.C2非編碼區(qū)可分為A、B1、B2和D四個系統(tǒng)進(jìn)化群。其中，A和B1群常存在于共生株，而B2和D群屬于攜帶毒力相關(guān)基因的條件腸外病原體。不同的系統(tǒng)進(jìn)化群分布皆由動物種類、健康狀態(tài)和所處地理位置決定的[4]。Obeng等[11]對南澳大利亞251株禽大腸桿菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)共生群(A和B1)占比分別為32.3%和39.4%，毒力群(B2和D)占比分別為11.2%和17.1%。Rodriguez等[12]研究美國患病家禽大腸桿菌發(fā)現(xiàn)，A群、B2群和D群分別占比38%、19%和28%。劉煥奇[13]等對我國雞大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群情況的研究結(jié)果表明，各分群占比為 A(34%)、B1(38.1%)、B2(6.2%)和 D(21.2%)。在本研究中220株雞大腸桿菌中A(38.64%)和 B1(35%)群共占比 73.64%，B2(9.55%)和 D(16.82%)群共占比26.37%，其中A和B1群占比與前述研究較為一致，D群占比與前述國外研究較一致，但低于劉煥奇等的研究結(jié)果。本研究在健康雞群中分離到B2群雞大腸桿菌，與劉煥奇等研究結(jié)果較為一致，但未見其它國家報道健康雞群中B2群分離情況。上述結(jié)果提示哈爾濱地區(qū)雞大腸桿菌可能具有較強致病力，尤其上述進(jìn)化分群在健康雞群中分離得到，也對雞養(yǎng)殖中雞大腸桿菌病的暴發(fā)風(fēng)險具有一定預(yù)警意義。

5 小結(jié)

哈爾濱地區(qū)健康雞群的泄殖腔拭子中分離到雞大腸桿菌257株，O血清型有39種，其中O8為優(yōu)勢血清型。系統(tǒng)進(jìn)化B2群和D群占全部菌株為26.37%。各分離菌株致病力暫未測定。研究結(jié)果表明當(dāng)前哈爾濱地區(qū)雞大腸桿菌血清型多樣，毒力情況復(fù)雜，應(yīng)建立針對性應(yīng)急預(yù)案。