劉存霞 ，費亦東 ，王銳 ，吳靜 ，田雪 ，趙巧雅 ，路曉 ，馬秀麗 **

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所 家禽疫病診斷與免疫重點實驗室，山東 濟南 250023；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130122；3.山東天牧生物科技有限公司，山東 東營 257500）

雞傳染性法氏囊?。↖BD）最早是由Cosgrove于1957年在美國甘布羅鎮(zhèn)的肉雞群中發(fā)現(xiàn)的，目前該病已呈世界性流行。據(jù)報道IBDV分為兩種血清型，血清Ⅰ型對雞致病，Ⅱ型對火雞致病，目前報道的雞的IBDV疫苗毒、強毒株均屬于血清Ⅰ型。該病毒主要侵害禽類的免疫中樞腔上囊而導致雞本身免疫機能障礙，從而增加對其他病原如禽流感、新城疫、細菌、支原體的易感性，雖然IBDV本身的致死率不高，因其破壞家禽的免疫系統(tǒng)，仍需從根本上加強對IBD的防制。近年來IBD臨床病例減少，本試驗在吉林省內(nèi)分離鑒定了IBD分離株，為該病的流行病學及防制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品、試驗動物和試劑 病料為2007年采自吉林大學動物醫(yī)院臨床送檢病死雞的法氏囊、脾臟，SPF（Specific pathogen free）雞胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所由本實驗室自行孵化，CEF細胞由軍事獸醫(yī)研究所病毒室制備。

IBDV瓊脂免疫擴散試驗陽性抗原、血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、Oligodt、 鼠源反轉(zhuǎn)錄酶、PCR產(chǎn)物連接試劑盒pMD18-T載體、T4DNA連接酶、BSA、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的兔抗雞IgY、RNA酶及各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司和 Promega公司；RNA提取試劑盒TRIzol Reagent購自美國MD公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。

1.2 引物設計 根據(jù)Mundt E等報告的IBDV cDNA序列及GenBank已發(fā)表的IBDV序列，在同時編碼VP5和VP2兩種蛋白質(zhì)的重疊基因保守性區(qū)設計一對引物（P1、P2）。

P1：5'-GGTCGGAGACTTCAACCTAC-3' ；P2：5'-TGAGAATTGGTAATCATCGG-3' ，擴增片段為536bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病料處理 無菌條件下取法氏囊，放入滅菌的西林瓶中用剪刀剪碎后轉(zhuǎn)入玻璃研磨器中研磨，按1：5的比例加入滅菌生理鹽水，同時加入雙抗（終濃度 100μg/μl），于 4℃冰箱放置 2～4h，反復凍融三次，3000r/min離心15min取上清液，再經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR檢測 取處理好的組織浸出液，用TRIzol Reagent試劑盒提取組織總RNA。依次加入 Rnase Free ddH2O 8μl、隨機引物 9mers 1μl、病毒 RNA 提取物 6μl，75℃ 5min，然后置于冰 盒 上 依 次 加 入 RNase Free ddH2O 5.5μl、5×RNA PCR Buffer 6μl、dNTP Mixture （10mmom/L）1.5μl、RNase Inhibitor 1μl、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1μl，42℃孵育60min，95℃滅活5min完成反轉(zhuǎn)錄。配制25μl PCR 反 應 體 系 ：10×Ex Buffe 2.5μl、dNTPs(10mM)0.5μl、ExTaq 酶 0.25μl、上游引物（20pM）、下游引物（20pM）各 0.5μl，上述 cDNA 4μl，補水至 25μl，PCR 反應條件為：94℃預變性 3min；94℃變性 30s；55℃退火 30s；72℃延伸 40s；30 個循環(huán)，72℃再延伸 10min。

1.5 目的片段克隆測序 PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，用回收試劑盒對目的片段進行回收純化與pMD18-T載體連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細胞。提取重組子的經(jīng)酶切鑒定陽性樣品送TAKARA寶生物大連有限公司進行測序。然后將所獲的序列在NCBI的Gene Bank中進行核酸序列比較。

1.6 病毒的分離與傳代 病毒在雞胚中傳代：取研磨液經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜接種SPF雞胚，0.1ml/胚，用醫(yī)用膠布封住卵窗并用石蠟封之。雞胚接種后，橫臥于溫箱中，不許翻動，保持卵窗向上。用檢卵燈每天檢卵一次，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，37℃恒溫培養(yǎng)至144h，將死亡雞胚置4℃冷藏，收集尿囊膜經(jīng)研磨、反復凍融3次后過濾除菌，連續(xù)傳代3～5代直至在雞胚接種后產(chǎn)生規(guī)律性病變。

病毒在CEF中傳代：取雞胚毒接種單層雞胚成纖維細胞（CEF），37℃ 5%CO2培養(yǎng) 3～5d，收獲細胞毒經(jīng)反復凍融3次，繼續(xù)在CEF上接種傳代，連續(xù)盲傳數(shù)代直至出現(xiàn)明顯的規(guī)律性細胞病變。

1.7 毒價測定 將 CEF制成 1.0～1.5×106/ml細胞懸液，以106個/ml細胞加入到96孔板中制成單層細胞，將分離株細胞毒以10-4～10-9系列稀釋，分別接種CEF細胞與9～11日齡的SPF雞胚，重復3次，按照Reed-Muench法分別計算其對細胞和雞胚的 TCID50/0.1ml、EID50/0.1ml。

1.8 血清學鑒定 進一步驗證分離株特異性，參照中華人民共和國國家標準GB/T 17999.4-1999進行SPF雞瓊脂擴散試驗及血凝試驗。

1.9 電鏡觀察 收集新鮮制備的病毒液，用銅網(wǎng)在混合均勻的樣品管中蘸取少量液體，用濾紙吸干銅網(wǎng)周邊的液體，晾干后滴上一滴磷鎢酸染液，作用1min后，用濾紙吸干，在透射電子顯微鏡下進行觀察、拍照。

1.10 間接免疫熒光法檢測（IFA） 將細胞適應毒接種于含CEF細胞單層的爬片上，同時設正常細胞對照，37℃，5%CO2培養(yǎng)至細胞出現(xiàn)明顯病變后，取出玻片用 PBS（pH7.2）洗滌一次，2%戊二醛固定玻片 15～30min，PBS沖洗 3次，每次5min；用含3%BSA的PBS 37℃封閉2h，加入一抗（1：300稀釋），37℃作用 2h，PBS沖洗 3次， 每次 5min；加入二抗（1：1000稀釋異硫氰酸熒光素（FITC）標記的兔抗雞IgY），室溫避光作用1h，用PBS洗滌3次，每次5min，自然晾干；在載玻片上加一滴50%甘油PBS緩沖液，反扣于載玻片上于熒光顯微鏡下觀察。

1.11 動物回歸試驗 取分離株的細胞毒接種28日齡的SPF雞，每組30只，每只經(jīng)滴鼻、點眼接種0.1ml，同時設空白對照5只，每天觀察并記錄發(fā)病情況，取法氏囊組織進行IBDV核酸檢測。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR電泳結(jié)果 分離株IBDV經(jīng)總RNA提取后進行RT-PCR，電泳可見536bp目的片段與預期大小一致。用本實驗室保存的質(zhì)粒pEX-IBDV-VP0作為陽性對照，電泳結(jié)果顯示可獲得536bp大小的目的片段，見圖1。

圖1 分離株RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 目的基因克隆及序列比對 RT-PCR擴增片段與pMD18-T載體連接后，克隆到感受態(tài)菌體中，從而獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR電泳，結(jié)果獲得與預期目的大小一致的536bp片段，如圖2。所得的基因序列與NCBI中的Gene Bank中的核酸序列進行比較，同源性99%。

圖2 重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 雞胚穩(wěn)定性試驗 病料懸液接種9～11日齡SPF雞胚后，可造成雞胚死亡。連續(xù)盲傳至第5代時，IBDV分離株適應雞胚，雞胚死亡時間集中在44～96h，并逐步趨于穩(wěn)定呈現(xiàn)一定的規(guī)律，病變部位及程度也出現(xiàn)明顯的規(guī)律性。剖檢死胚可見絨毛尿囊膜增厚水腫，死亡胚體周身水腫，發(fā)育不良，體表有明顯的出血現(xiàn)象，以頭部、背部、腿部出血較嚴重，肝臟腫大并有灰白色壞死灶，腎臟輕度腫脹，如圖3所示。

圖3 接種分離株IBDV 44～96h死亡的SPF胚

2.4 IBDV分離株在CEF中的穩(wěn)定性試驗 IBDV分離株在CEF細胞中盲傳第6代時仍未出現(xiàn)任何細胞病變。直到第7代開始出現(xiàn)少量的細胞變圓、脫落的現(xiàn)象。繼續(xù)盲傳至第9代時開始出現(xiàn)明顯的細胞病變，且病變發(fā)生時間逐漸穩(wěn)定，顯微鏡下可以明顯看到CEF細胞變圓、脫落、呈拉網(wǎng)狀。如圖4所示。結(jié)果表明，成功分離出IBDV，并使其適應CEF細胞。

圖4 IBDV分離株接種CEF病變圖

2.5 IBDV分離株毒價測定結(jié)果 將分離株分別在SPF雞胚及CEF中測定毒價，按照Reed-Muench法分別計算出0.1ml尿囊膜懸液中病毒JL-01 的 EID50分 別 為 104.5/0.1ml、104.75/0.1ml、104.5/0.1ml。 TCID50分別為 107.43/0.1ml、106.75/0.1ml、106.5/0.1ml。

2.6 血清學鑒定結(jié)果 瓊脂擴散試驗結(jié)果顯示分離株與IBD標準抗體之間出現(xiàn)明顯的單一的一條白色沉淀線，而陰性對照未見沉淀線。血凝試驗結(jié)果顯示待檢樣本未見有紅細胞凝集，而AIV、NDV陽性對照可見明顯的紅細胞凝集，表明無AIV、DNA污染。

2.7 電鏡結(jié)果 在透射電子顯微鏡下可以觀察到大小在60nm左右的、呈六邊形的散在的病毒粒子，除了完整的病毒粒子，也可見空衣殼，見圖5。

圖5 IBDV病毒粒子電鏡圖

2.8 IFA檢測結(jié)果 IFA檢測結(jié)果顯示，IBDV分離株感染CEF細胞后，經(jīng)特異性抗體反應，在病變CEF細胞中可見明顯的綠色熒光，而正常細胞對照無特異性熒光，見圖6。

圖6 IBDV分離株的間接免疫熒光法檢測

2.9 動物回歸試驗結(jié)果 SPF雞于接種后第3天開始出現(xiàn)IBD的典型臨床癥狀：病雞精神萎頓，羽毛松亂，下痢、共濟失調(diào)。發(fā)病率100%，死亡率5%～20%。第4天開始死亡。剖檢可見胸肌、腿肌有片狀出血，法氏囊嚴重水腫，內(nèi)含淡黃色膠凍樣滲出物，褶皺粘膜面上有針尖狀出血點，少數(shù)法氏囊彌漫性出血；胸腺萎縮，腎臟輕度腫脹、未見有尿酸鹽沉積；盲腸扁桃體腫大出血；接種30只SPF雞，死亡5只，死亡率為16.7%，對照組均未見明顯變化，見圖7。取法氏囊按1.3病料處理方法經(jīng)PCR檢測為陽性。

圖7 SPF雞接種后出現(xiàn)IBD的典型臨床癥狀

3 分析與討論

本試驗參照周蛟[1]的方法在吉林長春地區(qū)對IBDV進行分離。Saijo K[2]研究認為，對法氏囊病毒的分離要經(jīng)過在雞胚上的增殖后，才能適應CEF。李漢秋等將北京IBD-CJ801株IBDV經(jīng)CEB傳9代，CEK傳8代，再在CEF上傳4代后，培育出了一株IBDV 毒株，毒價為 106.5～107.6TCID50/0.1ml?，F(xiàn)在大多數(shù)實驗室都用CEF增殖IBDV，但并不是所有分離株都能適應于CEF[3]。本研究利用雞接種5代次取雞胚適應毒經(jīng)CEF培養(yǎng)盲傳，盲傳至第7代開始出現(xiàn)少量細胞圓縮，繼續(xù)在CEF細胞中傳代至逐漸適應CEF細胞并產(chǎn)生有規(guī)律的CPE，通過對分離株的毒價測定，本試驗分離的IBDV的毒價與李漢秋在北京分離的病毒毒價相近。

研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)散在IBDV強毒株感染[4-6]，由于傳染性法氏囊病是一種免疫抑制病，臨床中常因免疫失敗導致其他疫病感染的敏感性提高，本試驗在吉林地區(qū)分離了IBDV，并對其進行了鑒定，擬用分離的IBDV株作為攻毒毒株檢測實驗室自行構(gòu)建的雞痘病毒載體活疫苗的免疫保護作用，為構(gòu)建的重組雞痘病毒活載體疫苗及其免疫保護性研究奠定了基礎，對評價重組雞痘病毒活載體疫苗對環(huán)境中IBDV的保護性研究具有重要的意義。