劉存霞 ,費亦東 ,王銳 ,吳靜 ,田雪 ,趙巧雅 ,路曉 ,馬秀麗 **
(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所 家禽疫病診斷與免疫重點實驗室,山東 濟南 250023;2.吉林大學動物醫(yī)學學院,吉林 長春 130122;3.山東天牧生物科技有限公司,山東 東營 257500)
雞傳染性法氏囊?。↖BD)最早是由Cosgrove于1957年在美國甘布羅鎮(zhèn)的肉雞群中發(fā)現(xiàn)的,目前該病已呈世界性流行。據(jù)報道IBDV分為兩種血清型,血清Ⅰ型對雞致病,Ⅱ型對火雞致病,目前報道的雞的IBDV疫苗毒、強毒株均屬于血清Ⅰ型。該病毒主要侵害禽類的免疫中樞腔上囊而導致雞本身免疫機能障礙,從而增加對其他病原如禽流感、新城疫、細菌、支原體的易感性,雖然IBDV本身的致死率不高,因其破壞家禽的免疫系統(tǒng),仍需從根本上加強對IBD的防制。近年來IBD臨床病例減少,本試驗在吉林省內(nèi)分離鑒定了IBD分離株,為該病的流行病學及防制奠定基礎。
1.1 樣品、試驗動物和試劑 病料為2007年采自吉林大學動物醫(yī)院臨床送檢病死雞的法氏囊、脾臟,SPF(Specific pathogen free)雞胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所由本實驗室自行孵化,CEF細胞由軍事獸醫(yī)研究所病毒室制備。
IBDV瓊脂免疫擴散試驗陽性抗原、血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、Oligodt、 鼠源反轉(zhuǎn)錄酶、PCR產(chǎn)物連接試劑盒pMD18-T載體、T4DNA連接酶、BSA、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗雞IgY、RNA酶及各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司和 Promega公司;RNA提取試劑盒TRIzol Reagent購自美國MD公司產(chǎn)品;PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。
1.2 引物設計 根據(jù)Mundt E等報告的IBDV cDNA序列及GenBank已發(fā)表的IBDV序列,在同時編碼VP5和VP2兩種蛋白質(zhì)的重疊基因保守性區(qū)設計一對引物(P1、P2)。
P1:5'-GGTCGGAGACTTCAACCTAC-3' ;P2:5'-TGAGAATTGGTAATCATCGG-3' ,擴增片段為536bp,由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 病料處理 無菌條件下取法氏囊,放入滅菌的西林瓶中用剪刀剪碎后轉(zhuǎn)入玻璃研磨器中研磨,按1:5的比例加入滅菌生理鹽水,同時加入雙抗(終濃度 100μg/μl),于 4℃冰箱放置 2~4h,反復凍融三次,3000r/min離心15min取上清液,再經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4 RT-PCR檢測 取處理好的組織浸出液,用TRIzol Reagent試劑盒提取組織總RNA。依次加入 Rnase Free ddH2O 8μl、隨機引物 9mers 1μl、病毒 RNA 提取物 6μl,75℃ 5min,然后置于冰 盒 上 依 次 加 入 RNase Free ddH2O 5.5μl、5×RNA PCR Buffer 6μl、dNTP Mixture (10mmom/L)1.5μl、RNase Inhibitor 1μl、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1μl,42℃孵育60min,95℃滅活5min完成反轉(zhuǎn)錄。配制25μl PCR 反 應 體 系 :10×Ex Buffe 2.5μl、dNTPs(10mM)0.5μl、ExTaq 酶 0.25μl、上游引物(20pM)、下游引物(20pM)各 0.5μl,上述 cDNA 4μl,補水至 25μl,PCR 反應條件為:94℃預變性 3min;94℃變性 30s;55℃退火 30s;72℃延伸 40s;30 個循環(huán),72℃再延伸 10min。
1.5 目的片段克隆測序 PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,用回收試劑盒對目的片段進行回收純化與pMD18-T載體連接過夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細胞。提取重組子的經(jīng)酶切鑒定陽性樣品送TAKARA寶生物大連有限公司進行測序。然后將所獲的序列在NCBI的Gene Bank中進行核酸序列比較。
1.6 病毒的分離與傳代 病毒在雞胚中傳代:取研磨液經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜接種SPF雞胚,0.1ml/胚,用醫(yī)用膠布封住卵窗并用石蠟封之。雞胚接種后,橫臥于溫箱中,不許翻動,保持卵窗向上。用檢卵燈每天檢卵一次,棄去24h內(nèi)死亡的雞胚,37℃恒溫培養(yǎng)至144h,將死亡雞胚置4℃冷藏,收集尿囊膜經(jīng)研磨、反復凍融3次后過濾除菌,連續(xù)傳代3~5代直至在雞胚接種后產(chǎn)生規(guī)律性病變。
病毒在CEF中傳代:取雞胚毒接種單層雞胚成纖維細胞(CEF),37℃ 5%CO2培養(yǎng) 3~5d,收獲細胞毒經(jīng)反復凍融3次,繼續(xù)在CEF上接種傳代,連續(xù)盲傳數(shù)代直至出現(xiàn)明顯的規(guī)律性細胞病變。
1.7 毒價測定 將 CEF制成 1.0~1.5×106/ml細胞懸液,以106個/ml細胞加入到96孔板中制成單層細胞,將分離株細胞毒以10-4~10-9系列稀釋,分別接種CEF細胞與9~11日齡的SPF雞胚,重復3次,按照Reed-Muench法分別計算其對細胞和雞胚的 TCID50/0.1ml、EID50/0.1ml。
1.8 血清學鑒定 進一步驗證分離株特異性,參照中華人民共和國國家標準GB/T 17999.4-1999進行SPF雞瓊脂擴散試驗及血凝試驗。
1.9 電鏡觀察 收集新鮮制備的病毒液,用銅網(wǎng)在混合均勻的樣品管中蘸取少量液體,用濾紙吸干銅網(wǎng)周邊的液體,晾干后滴上一滴磷鎢酸染液,作用1min后,用濾紙吸干,在透射電子顯微鏡下進行觀察、拍照。
1.10 間接免疫熒光法檢測(IFA) 將細胞適應毒接種于含CEF細胞單層的爬片上,同時設正常細胞對照,37℃,5%CO2培養(yǎng)至細胞出現(xiàn)明顯病變后,取出玻片用 PBS(pH7.2)洗滌一次,2%戊二醛固定玻片 15~30min,PBS沖洗 3次,每次5min;用含3%BSA的PBS 37℃封閉2h,加入一抗(1:300稀釋),37℃作用 2h,PBS沖洗 3次, 每次 5min;加入二抗(1:1000稀釋異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗雞IgY),室溫避光作用1h,用PBS洗滌3次,每次5min,自然晾干;在載玻片上加一滴50%甘油PBS緩沖液,反扣于載玻片上于熒光顯微鏡下觀察。
1.11 動物回歸試驗 取分離株的細胞毒接種28日齡的SPF雞,每組30只,每只經(jīng)滴鼻、點眼接種0.1ml,同時設空白對照5只,每天觀察并記錄發(fā)病情況,取法氏囊組織進行IBDV核酸檢測。
2.1 RT-PCR電泳結(jié)果 分離株IBDV經(jīng)總RNA提取后進行RT-PCR,電泳可見536bp目的片段與預期大小一致。用本實驗室保存的質(zhì)粒pEX-IBDV-VP0作為陽性對照,電泳結(jié)果顯示可獲得536bp大小的目的片段,見圖1。
圖1 分離株RT-PCR產(chǎn)物電泳圖
2.2 目的基因克隆及序列比對 RT-PCR擴增片段與pMD18-T載體連接后,克隆到感受態(tài)菌體中,從而獲得重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR電泳,結(jié)果獲得與預期目的大小一致的536bp片段,如圖2。所得的基因序列與NCBI中的Gene Bank中的核酸序列進行比較,同源性99%。
圖2 重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖
2.3 雞胚穩(wěn)定性試驗 病料懸液接種9~11日齡SPF雞胚后,可造成雞胚死亡。連續(xù)盲傳至第5代時,IBDV分離株適應雞胚,雞胚死亡時間集中在44~96h,并逐步趨于穩(wěn)定呈現(xiàn)一定的規(guī)律,病變部位及程度也出現(xiàn)明顯的規(guī)律性。剖檢死胚可見絨毛尿囊膜增厚水腫,死亡胚體周身水腫,發(fā)育不良,體表有明顯的出血現(xiàn)象,以頭部、背部、腿部出血較嚴重,肝臟腫大并有灰白色壞死灶,腎臟輕度腫脹,如圖3所示。
圖3 接種分離株IBDV 44~96h死亡的SPF胚
2.4 IBDV分離株在CEF中的穩(wěn)定性試驗 IBDV分離株在CEF細胞中盲傳第6代時仍未出現(xiàn)任何細胞病變。直到第7代開始出現(xiàn)少量的細胞變圓、脫落的現(xiàn)象。繼續(xù)盲傳至第9代時開始出現(xiàn)明顯的細胞病變,且病變發(fā)生時間逐漸穩(wěn)定,顯微鏡下可以明顯看到CEF細胞變圓、脫落、呈拉網(wǎng)狀。如圖4所示。結(jié)果表明,成功分離出IBDV,并使其適應CEF細胞。
圖4 IBDV分離株接種CEF病變圖
2.5 IBDV分離株毒價測定結(jié)果 將分離株分別在SPF雞胚及CEF中測定毒價,按照Reed-Muench法分別計算出0.1ml尿囊膜懸液中病毒JL-01 的 EID50分 別 為 104.5/0.1ml、104.75/0.1ml、104.5/0.1ml。 TCID50分別為 107.43/0.1ml、106.75/0.1ml、106.5/0.1ml。
2.6 血清學鑒定結(jié)果 瓊脂擴散試驗結(jié)果顯示分離株與IBD標準抗體之間出現(xiàn)明顯的單一的一條白色沉淀線,而陰性對照未見沉淀線。血凝試驗結(jié)果顯示待檢樣本未見有紅細胞凝集,而AIV、NDV陽性對照可見明顯的紅細胞凝集,表明無AIV、DNA污染。
2.7 電鏡結(jié)果 在透射電子顯微鏡下可以觀察到大小在60nm左右的、呈六邊形的散在的病毒粒子,除了完整的病毒粒子,也可見空衣殼,見圖5。
圖5 IBDV病毒粒子電鏡圖
2.8 IFA檢測結(jié)果 IFA檢測結(jié)果顯示,IBDV分離株感染CEF細胞后,經(jīng)特異性抗體反應,在病變CEF細胞中可見明顯的綠色熒光,而正常細胞對照無特異性熒光,見圖6。
圖6 IBDV分離株的間接免疫熒光法檢測
2.9 動物回歸試驗結(jié)果 SPF雞于接種后第3天開始出現(xiàn)IBD的典型臨床癥狀:病雞精神萎頓,羽毛松亂,下痢、共濟失調(diào)。發(fā)病率100%,死亡率5%~20%。第4天開始死亡。剖檢可見胸肌、腿肌有片狀出血,法氏囊嚴重水腫,內(nèi)含淡黃色膠凍樣滲出物,褶皺粘膜面上有針尖狀出血點,少數(shù)法氏囊彌漫性出血;胸腺萎縮,腎臟輕度腫脹、未見有尿酸鹽沉積;盲腸扁桃體腫大出血;接種30只SPF雞,死亡5只,死亡率為16.7%,對照組均未見明顯變化,見圖7。取法氏囊按1.3病料處理方法經(jīng)PCR檢測為陽性。
圖7 SPF雞接種后出現(xiàn)IBD的典型臨床癥狀
本試驗參照周蛟[1]的方法在吉林長春地區(qū)對IBDV進行分離。Saijo K[2]研究認為,對法氏囊病毒的分離要經(jīng)過在雞胚上的增殖后,才能適應CEF。李漢秋等將北京IBD-CJ801株IBDV經(jīng)CEB傳9代,CEK傳8代,再在CEF上傳4代后,培育出了一株IBDV 毒株,毒價為 106.5~107.6TCID50/0.1ml?,F(xiàn)在大多數(shù)實驗室都用CEF增殖IBDV,但并不是所有分離株都能適應于CEF[3]。本研究利用雞接種5代次取雞胚適應毒經(jīng)CEF培養(yǎng)盲傳,盲傳至第7代開始出現(xiàn)少量細胞圓縮,繼續(xù)在CEF細胞中傳代至逐漸適應CEF細胞并產(chǎn)生有規(guī)律的CPE,通過對分離株的毒價測定,本試驗分離的IBDV的毒價與李漢秋在北京分離的病毒毒價相近。
研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)散在IBDV強毒株感染[4-6],由于傳染性法氏囊病是一種免疫抑制病,臨床中常因免疫失敗導致其他疫病感染的敏感性提高,本試驗在吉林地區(qū)分離了IBDV,并對其進行了鑒定,擬用分離的IBDV株作為攻毒毒株檢測實驗室自行構(gòu)建的雞痘病毒載體活疫苗的免疫保護作用,為構(gòu)建的重組雞痘病毒活載體疫苗及其免疫保護性研究奠定了基礎,對評價重組雞痘病毒活載體疫苗對環(huán)境中IBDV的保護性研究具有重要的意義。