鐘意欣禾，胡 珂，彭華勝，彭代銀

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012)

中藥延胡索為罌粟科多年生植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang ex Z. Y. Su et C. Y. Wu)的干燥塊莖[1]，自唐代起就有其入藥的相關(guān)記載。如今使用的延胡索多產(chǎn)于浙江，在陜西漢中等地也有大面積的引種栽培[2]。延胡索塊莖主要含生物堿，可分為原小檗堿類、阿樸啡類、原阿片堿類、異喹啉苯并菲啶類等[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，這些生物堿能作用于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)，起到鎮(zhèn)痛、降低嗎啡成癮性、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗心律失常、抗血栓等多種作用。本研究通過(guò)對(duì)栽培延胡索的基原植物——生延胡索進(jìn)行適時(shí)跟蹤采集，觀察不同時(shí)期其塊莖各部分組織的生長(zhǎng)規(guī)律及生物堿的分布狀況，以期為今后促進(jìn)延胡索有效生物堿成分的積累提供依據(jù)。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料 2016年11月至2017年4月，每月在安徽省合肥市大蜀山北坡采集一年及多年生野生延胡索新鮮塊莖，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)胡珂教授鑒定為罌粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang ex Z. Y. Su et C. Y. Wu)的塊莖。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)型石蠟切片機(jī)(Leica RM2265)：德國(guó)；烘干機(jī)；烘片機(jī)(Leica HI1220)：上海徠卡儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡(Olypus BH2)；冰凍切片機(jī)(Leica CM1850UV)；熒光顯微鏡(Olympus BX51)；顯微攝像儀。

1.3 試劑 FAA固定液(70%乙醇-冰醋酸-甲醛，18∶1∶1)：上海聚泰特種試劑有限公司；濃度梯度乙醇(分析純)、濃度梯度二甲苯(分析純)：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；石蠟；藏紅T、固綠：上海源葉生物科技有限公司；中性樹膠；膠水。

2 方法

2.1 延胡索塊莖石蠟切片的制作與觀察 于2016年11月至2017年4月每月在大蜀山挖取一年生及多年生延胡索塊莖若干，帶土轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室后用FAA固定液固定。常規(guī)制作石蠟切片后置光學(xué)顯微鏡下觀察、拍攝照片并記錄。

2.2 延胡索塊莖冰凍切片的制作與觀察 冰凍切片的冷凍溫度和冷凍時(shí)間對(duì)切片質(zhì)量有很大的影響[4]，因此在經(jīng)過(guò)一系列嘗試后最終以冷凍箱溫度-18 ℃、冷凍15 min為條件，切25 μm的薄片后直接放于熒光顯微鏡下觀察，拍攝照片并記錄。

2.3 陰性對(duì)照 將切好的延胡索薄片用酸性醇溶液處理洗脫其中的生物堿后，放在熒光顯微鏡下觀察，拍攝照片并記錄。

3 結(jié)果

3.1 多年生塊莖的組織結(jié)構(gòu)變化 延胡索多年生塊莖的地下形態(tài)在休眠期為結(jié)實(shí)飽滿的球形，直至3月份地上部分開花期間，塊莖外部質(zhì)地變得松泡，內(nèi)部產(chǎn)生飽滿的新生塊莖。其顯微結(jié)構(gòu)類似于莖的初生構(gòu)造，從外向內(nèi)分別為木栓層、皮層薄壁組織、形成層以及髓。沒(méi)有明顯的木栓形成層，且形成層處產(chǎn)生“生長(zhǎng)點(diǎn)”，若產(chǎn)生一個(gè)以上的生長(zhǎng)點(diǎn)則呈對(duì)稱分布?！吧L(zhǎng)點(diǎn)”于1月份開始經(jīng)2～3個(gè)月分生擴(kuò)大成新的塊莖，其以外的薄壁組織淀粉粒減少，纖維化成為頹廢組織。見(jiàn)圖1。

3.2 一年生塊莖的組織結(jié)構(gòu)變化 延胡索一年生塊莖可以由種子直接發(fā)育形成，或由多年生塊莖的地下橫走莖節(jié)處膨大產(chǎn)生。前者為未充分發(fā)育的塊莖結(jié)構(gòu)[5]，后者由于其產(chǎn)生位置處會(huì)形成一個(gè)凹痕，在野生條件下比較容易區(qū)分，因此用于制作石蠟切片。結(jié)果顯示其顯微結(jié)構(gòu)與多年生塊莖相似，只是形成層常成不規(guī)則狀。見(jiàn)圖2。

3.3 延胡索塊莖生物堿分布規(guī)律 熒光顯微鏡下可見(jiàn)延胡索的新鮮冰凍切片除形成層外幾乎所有部分都發(fā)黃綠色熒光。其中靠近木栓層部分的皮層薄壁組織熒光強(qiáng)度要高于其他部分。新生塊莖的皮層薄壁組織亮度也較高。一年生塊莖的凹陷處木栓化細(xì)胞呈現(xiàn)不同的黃色。在塊莖出現(xiàn)松泡后，破碎的薄壁細(xì)胞也呈現(xiàn)亮黃綠色熒光。陰性對(duì)照顯示在洗去生物堿后皮層薄壁組織幾乎沒(méi)有明顯的熒光差異，而木栓層依舊較亮。見(jiàn)圖3。

4 討論

4.1 延胡索塊莖的組織發(fā)育特點(diǎn) 延胡索塊莖的組織結(jié)構(gòu)大體分為木栓層、皮層薄壁組織、形成層以及髓4個(gè)部分，并依靠其形成層上隨機(jī)產(chǎn)生的具有強(qiáng)烈分生能力的“生長(zhǎng)點(diǎn)”，以一年為周期進(jìn)行新舊交替。野生延胡索“生長(zhǎng)點(diǎn)”常為2個(gè)，而有資料顯示栽培品種可見(jiàn)2～3個(gè)，且都呈對(duì)稱分布[6]?？梢?jiàn)其產(chǎn)生與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有著密切的聯(lián)系，而促進(jìn)“生長(zhǎng)點(diǎn)”產(chǎn)生可使其繁殖率得到提高。與此同時(shí)，淀粉作為植物儲(chǔ)存能量的一種方式，也跟隨塊莖的新舊交替產(chǎn)生消長(zhǎng)變化。因此，延胡索在夏初地上莖枯萎時(shí)采收，此時(shí)延胡索已經(jīng)完成了新舊代替，淀粉粒含量充足，產(chǎn)量質(zhì)量最佳。

注:A、B、D.不規(guī)則的形成層;C.可見(jiàn)生長(zhǎng)點(diǎn);E.向兩邊延伸的形成層;F.疏松的原皮層薄壁細(xì)胞,擴(kuò)大且占主要位置的生長(zhǎng)點(diǎn);向左箭頭指向形成層,向上箭頭指向生長(zhǎng)點(diǎn),向下箭頭指向新形成層,向右箭頭指向原生導(dǎo)管,右上箭頭指向原皮層薄壁細(xì)胞;標(biāo)尺示200 μm圖2 一年生延胡索石蠟切片(4×10倍)

4.2 生物堿的積累規(guī)律 生物堿是一種在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要作用的次生代謝產(chǎn)物，存在于100多個(gè)科的植物中[7]。延胡索中生物堿成分在紫外光下受到激發(fā)后會(huì)呈現(xiàn)黃綠色熒光，并且熒光強(qiáng)度與含量成正比[8]，因此能在熒光顯微鏡下直觀地看到生物堿在其塊莖中的分布特點(diǎn)。

有研究顯示，植物次生代謝產(chǎn)物總是分布在易受侵害的組織中，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同生長(zhǎng)時(shí)期延胡索中幾乎各個(gè)組織部位均含有生物堿，其中靠近木栓層內(nèi)部的生物堿含量較高。木栓層是進(jìn)行次生生長(zhǎng)的植物的重要保護(hù)組織，因此二者是相符合的。但由于延胡索中含有大量淀粉粒以及具有強(qiáng)烈熒光反應(yīng)的木質(zhì)素可能會(huì)對(duì)熒光反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生干擾，且酸對(duì)木質(zhì)素沒(méi)有影響[9]，因此，本研究觀察單純淀粉粒的熒光反應(yīng)以及利用酸性醇溶液對(duì)生物堿進(jìn)行抽提后的塊莖切片，結(jié)果顯示單純的淀粉粒在熒光顯微鏡下并沒(méi)有顯示熒光，這可能與其熒光強(qiáng)度太弱有關(guān)；而提取生物堿后，靠近木栓層內(nèi)側(cè)的熒光差異消失。由此可見(jiàn)，生物堿在塊莖中的分布是具有差異的，且這種差異并不隨時(shí)間的變化而產(chǎn)生不同部位的定向聚集性。

注:A.木栓層內(nèi)側(cè)明顯較亮(多年生塊莖,×10倍);B.外側(cè)皮層薄壁組織較亮(多年生塊莖,×5倍);C.纖維化的皮層薄壁組織(多年生塊莖,×5倍);D.新生塊莖熒光顯微(多年生塊莖,×5倍);E.靠近凹陷部分的導(dǎo)管呈黃色(一年生塊莖,×5倍);F.陰性對(duì)照(多年生塊莖,×5倍);向左箭頭指向木栓層,向下箭頭指向外皮層,向上箭頭指向纖維皮層;A中標(biāo)尺為100 μm,其余圖片中標(biāo)尺皆為200 μm圖3 新鮮延胡索塊莖冰凍切片

在皮層薄壁組織發(fā)生松軟破裂時(shí)，其仍具有較高的生物堿含量，由此推測(cè)這些化學(xué)物質(zhì)可能具有一定的防御作用，而一年生塊莖凹陷處的木栓化細(xì)胞呈現(xiàn)顏色不同的黃色熒光，提示此處的生物堿成分可能不同。另外，許多研究顯示生物堿在植物中的積累還受到環(huán)境及生物因子的影響，如無(wú)機(jī)物的供給、溫度、海拔、真菌的攻擊[10]，因此對(duì)于延胡索塊莖中生物堿分布的影響因素還可進(jìn)一步深入研究。

4.3 生物堿分布與淀粉粒的關(guān)系 皮層薄壁組織熒光強(qiáng)度隨著淀粉粒的增加而增加，而沒(méi)有淀粉粒的形成層部位則幾乎沒(méi)有熒光，推測(cè)其生物堿含量可能與淀粉粒有關(guān)。有相關(guān)文獻(xiàn)顯示，貝母栽培品種的生物堿含量與淀粉粒的積累無(wú)規(guī)律的相關(guān)，而野生品種則與淀粉含量呈正相關(guān)[11]。究竟此類以地下莖入藥的植物生物堿含量與淀粉粒的產(chǎn)生有何聯(lián)系，還需要進(jìn)一步的研究。