董兆旻，謝先梅，孫 穎，戴 敏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

高脂血癥是指生物體內(nèi)脂質(zhì)代謝失常，是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生的主要誘因和早期病變。肝臟是脂質(zhì)代謝的主要器官，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是脂質(zhì)代謝關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)者，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝可促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出，減少脂質(zhì)積累，防止泡沫細(xì)胞形成，抑制AS的形成[1]。自噬是細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境壓力變化的一種反應(yīng)，是在自噬相關(guān)基因調(diào)控下通過溶酶體來降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)的過程，并能為細(xì)胞提供自我更新的營(yíng)養(yǎng)及材料，使其能在饑餓和各種應(yīng)激環(huán)境下維持自身穩(wěn)態(tài)[2-3]。自噬在AS發(fā)生發(fā)展的不同階段可能發(fā)揮著重要的作用[4]，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ型(microtubule-associated protein 1 light 3, type 2，LC3Ⅱ)、p62表達(dá)水平可作為衡量自噬水平的重要指征。然而在AS發(fā)病前期肝臟脂質(zhì)代謝紊亂時(shí)自噬處于何種狀態(tài)目前尚未見報(bào)道。丹皮酚(paeonol，Pae)是從毛茛科植物牡丹(PaeoniaSuffruticoasAndr.)的干燥根皮中提取的主要活性成分之一，具有調(diào)脂和抗AS作用[5-7]，還能調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達(dá)[8]。至今還沒有研究證實(shí)Pae對(duì)高脂狀態(tài)下肝臟自噬水平的影響。本研究探索Pae對(duì)高脂血癥大鼠肝臟脂質(zhì)代謝及自噬的影響，為進(jìn)一步揭示Pae抗AS早期病變的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 Pae(純度99%，批號(hào) 20170306)：安徽省宣城百草植物工貿(mào)有限公司；雷帕鳴(含雷帕霉素1 mg，批號(hào) S70704)：美國(guó)惠氏制藥；立普妥(含阿托伐他汀片10 mg，批號(hào) S87401)：美國(guó)惠氏制藥；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)：上海試劑一廠；維生素D2注射液(批號(hào) 16112601)：江西贛南海欣藥業(yè)股份有限公司；LC3抗體(ab128025)、PPARγ抗體(ab209350)、p62抗體(ab56416)：美國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)7～8周齡雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(皖)2017-001]，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房中，在溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度45%～65%，光照/黑暗周期為12 h/12 h的條件下飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)征得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

1.3 主要儀器 CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡：德國(guó)Leica公司；H-7650透射電子顯微鏡：日本Hitachi公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 將56只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)均分7組(每組8只)：正常對(duì)照組，模型組，Pae高、中、低劑量組，雷帕霉素組，阿托伐他汀組。在模型復(fù)制同時(shí)，正常對(duì)照組和模型組給予等容量0.5% CMC-Na，Pae高、中、低劑量組分別給予含Pae 300、150、75 mg/kg的0.5% CMC-Na，雷帕霉素組給予含雷帕霉素0.2 mg/kg的0.5% CMC-Na，阿托伐他汀組給予含阿托伐他汀5 mg/kg的0.5% CMC-Na。灌胃容積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)6周。

2.2 模型復(fù)制 正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料(3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油，81.3%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，除正常對(duì)照組外，在高脂飼料喂養(yǎng)前，其余各組大鼠一次性腹腔注射維生素D260萬U/kg。每周稱體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，所有動(dòng)物自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)6周。

2.3 脂質(zhì)水平檢測(cè) 大鼠禁食不禁水12 h后，稱質(zhì)量，采用3.5%水合氯醛生理鹽水溶液10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈分叉處取血，3 000 r/min離心10 min，得血清，備用。取大鼠肝右葉尖同一部位，準(zhǔn)確稱取0.2 g，按1∶9[質(zhì)量(g)∶體積(mL)]的比例，加入9倍的無水乙醇1.8 mL，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液。將血清及肝勻漿上清液通過全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清及肝臟的總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)水平。

2.4 肝系數(shù)水平的檢測(cè) 動(dòng)物處死后，取肝臟，置冰冷的生理鹽水中反復(fù)沖洗，剔除脂肪及結(jié)締組織。濾紙吸干表面水分后準(zhǔn)確稱質(zhì)量，計(jì)算肝質(zhì)量系數(shù)(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)。

2.5 肝臟組織形態(tài)學(xué)積分標(biāo)準(zhǔn) 取肝臟左葉尖同一部位，用10%中性甲醛固定，組織標(biāo)本脫水，常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片，切片厚度3 μm。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察主動(dòng)脈組織病理改變。計(jì)算機(jī)病理圖像分析軟件測(cè)定，對(duì)結(jié)果進(jìn)行量化。①肝臟脂肪變性程度評(píng)分：根據(jù)脂肪變性累計(jì)體積占肝組織體積百分比劃分等級(jí)并計(jì)分，<5%，計(jì)0分；5%～33%，計(jì)1分；>33%，且≤66%，計(jì)2分；>66%，計(jì)3分。

2.6 電鏡下觀察肝臟自噬小體 每組隨機(jī)抽取3只大鼠，取大鼠肝左葉同一部位，切成1 mm3左右，迅速固定于2.5%戊二醛中，置4 ℃冰箱，充分固定后，用0.1 mol/L磷酸緩沖液充分清洗，1%鋨酸中固定1 h。再按50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、90%丙酮、90%丙酮、100%丙酮的順序進(jìn)行梯度脫水，每梯度脫水2次，每次5 min。純環(huán)氧樹脂包埋劑包理，超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾、枸櫞鉛雙重染色，各10 min，透射電鏡下觀察各組大鼠肝細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)及其包裹物質(zhì)，拍照記錄。

2.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝臟PPARγ、LC3Ⅱ、p62表達(dá)水平 采用免疫組織化學(xué)二步法檢測(cè)肝臟PPARγ、LC3Ⅱ、p62的表達(dá)水平，于顯微鏡下觀察，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)陽性率(總陽性面積/圖片總面積×100%)進(jìn)行量化。

3 結(jié)果

3.1 Pae對(duì)高脂血癥大鼠血清和肝臟脂質(zhì)水平及肝系數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清和肝臟中TG、TC水平和肝系數(shù)均顯著增加(P<0.05)，提示大鼠高脂血癥模型復(fù)制成功。Pae高、中、低劑量組大鼠血清和肝臟中TG、TC水平和肝系數(shù)呈劑量依賴性地降低，與阿托伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示Pae具有改善血脂紊亂的作用。見表1。

表1 Pae對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)水平及肝系數(shù)的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 Pae對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織形態(tài)的影響 HE染色顯示，正常對(duì)照組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)排列正常，肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整，中央有核，胞質(zhì)均勻，無脂滴；模型組大鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡樣變性，為重度肝細(xì)胞變性；各給藥組大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性程度減輕，脂滴數(shù)量減少，有一定程度的改善。定量分析結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟脂肪變性評(píng)分(2.75±0.50)較正常對(duì)照組(0.25±0.50)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Pae低、中、高劑量組和阿托伐他汀組大鼠肝臟脂肪變性評(píng)分分別為(2.00±0.00)、(1.50±0.58)、(1.25±0.50)、(1.25±0.50)，較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注:A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.阿托伐他汀組;D. Pae低劑量組;E. Pae中劑量組;F. Pae高劑量組圖1 Pae對(duì)高脂血癥大鼠肝臟脂肪病變的影響(HE染色,10×40倍,n=8)

3.3 電鏡下各組高脂血癥大鼠肝臟組織自噬小體變化比較 正常對(duì)照組肝臟細(xì)胞質(zhì)中未見自噬小體；模型組肝臟細(xì)胞質(zhì)中可見大量脂質(zhì)體，可見少量自噬體及被包裹的降解物；Pae低、中、高劑量組肝臟細(xì)胞質(zhì)中可見較多的自噬體及被包裹的降解物，脂滴的數(shù)量較模型組減少，且隨Pae劑量增加，自噬體數(shù)量逐漸增加；雷帕霉素組肝臟細(xì)胞質(zhì)中可見較多的自噬體及被包裹的降解物。見圖2。

3.4 Pae對(duì)大鼠肝臟PPARγ、LC3Ⅱ、P62表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟LC3Ⅱ表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)，p62和PPAR-γ表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。與模型組相比較，Pae高、中、低劑量組，雷帕霉素組LC3Ⅱ表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，p62表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Pae對(duì)大鼠肝臟LC3Ⅱ和p62的效應(yīng)呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；Pae中、高劑量組和阿托伐他汀組PPAR-γ表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。見圖3、圖4。

注:A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.雷帕霉素組;D. Pae低劑量組;E. Pae中劑量組;F. Pae高劑量組圖2 電鏡下各組大鼠肝臟組織自噬小體變化比較(×4 000倍)

4 討論

高脂血癥是一種臨床常見而多發(fā)的代謝性疾病，是因生物體內(nèi)脂代謝異常導(dǎo)致血漿內(nèi)脂質(zhì)濃度高于正常水平的一種疾病，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等重要危險(xiǎn)因素之一。本研究中，采用大劑量腹腔注射維生素D2與高脂飼料喂養(yǎng)后大鼠血脂和肝脂水平明顯升高，結(jié)合對(duì)高脂大鼠肝臟病理學(xué)結(jié)果的分析，均表明高脂模型復(fù)制成功。脂質(zhì)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，Pae通過降低血漿及肝臟中TC、TG達(dá)到干預(yù)高脂血癥病變發(fā)展的作用，同時(shí)肝系數(shù)的比較結(jié)果也提示Pae具有抑制高脂血癥病變發(fā)展的作用。PPARγ是脂質(zhì)代謝關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，同時(shí)具有調(diào)節(jié)血脂等作用，可作為衡量脂質(zhì)代謝水平的標(biāo)志因子。本研究結(jié)果顯示，Pae可提高PPARγ的表達(dá)水平，且與阿托伐他汀組無明顯差異。說明Pae對(duì)高脂大鼠肝臟脂質(zhì)代謝具有促進(jìn)作用。

圖3 各組大鼠肝臟LC3Ⅱ、P62、PPARγ表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)染色法，10×40倍)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

脂質(zhì)代謝紊亂是高脂血癥發(fā)生的根本原因，一般情況下脂質(zhì)代謝有兩種途徑：一是通過胞質(zhì)中性化水解酶降解脂質(zhì)進(jìn)行的；二是通過自噬溶酶體降解脂質(zhì)進(jìn)行的[9]，該途徑與自噬相關(guān)。近年來有不少研究顯示，自噬與脂質(zhì)代謝的關(guān)系是相互作用的，抑制自噬會(huì)阻礙脂質(zhì)代謝，使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加[10-11]；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加會(huì)反向調(diào)節(jié)自噬，使自噬受到抑制，這種相互關(guān)系可能會(huì)使細(xì)胞陷入惡性循環(huán)，抑制自噬會(huì)促進(jìn)脂質(zhì)積累，進(jìn)而進(jìn)一步抑制自噬功能，從而增加脂質(zhì)積累，最終導(dǎo)致高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。本研究采用電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)Pae組大鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)中可見較多的自噬體及被包裹的降解物，脂滴的數(shù)量較模型組減少，且隨Pae劑量增加，自噬體數(shù)量依次增加，表明Pae促進(jìn)脂質(zhì)代謝的同時(shí)伴隨自噬發(fā)生，且自噬程度隨Pae劑量增加而提升。LC3Ⅱ是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，可作為自噬發(fā)生的分子標(biāo)志物，而p62是一種多功能蛋白，既是連接自噬體與泛素化標(biāo)記蛋白質(zhì)聚合體的橋梁，同時(shí)也是自噬過程的選擇性底物，可作為自噬能力的指征[12-13]。為了進(jìn)一步研究Pae與自噬和脂質(zhì)代謝的關(guān)系，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組LC3Ⅱ、P62的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Pae可促進(jìn)LC3Ⅱ表達(dá)，抑制p62表達(dá)，且與雷帕霉素組無顯著性差異。說明Pae可激活自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ、p62的表達(dá)。

本研究在建立高脂血癥模型基礎(chǔ)上，探討Pae對(duì)脂質(zhì)代謝和自噬均有明顯的調(diào)節(jié)作用，然而尚不清楚Pae的調(diào)節(jié)血脂作用與自噬的關(guān)系，本課題組將在后續(xù)研究中作更深入的探討。