王 磊，孫文利，劉紅星

(河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院，河北廊坊 065201)

泊沙康唑是新一代三唑類廣譜抗真菌藥物，是被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于預(yù)防侵襲性曲霉菌感染的一線藥物，可用于13歲以上嚴(yán)重免疫抑制患者侵襲性真菌感染和念珠菌感染的預(yù)防和治療[1]，還可用于無(wú)法耐受常用抗真菌藥物成人患者的侵襲性曲霉病、鐮刀菌病、慢性芽生菌病、分枝桿菌病和球孢子菌病的治療[2]。侵襲性曲霉菌感染是移植患者最危險(xiǎn)的并發(fā)癥之一，病死率高，常推薦口服泊沙康唑預(yù)防感染。藥物低暴露量與泊沙康唑臨床療效不佳密切相關(guān)，藥物高暴露量則可增加藥物的毒性反應(yīng)。美國(guó)傳染病學(xué)(IDSA)2007年更新的《組織胞漿病治療指南》也指出，由于個(gè)體間變異和潛在的藥物相互作用，測(cè)定穩(wěn)態(tài)血藥濃度有助于提高療效[3-4]。多數(shù)研究認(rèn)為泊沙康唑血漿谷值與抗真菌療效最相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)參數(shù)AUC24/MIC有較好的相關(guān)性[5-8]。因此，通過(guò)檢測(cè)泊沙康唑血漿谷值可以有效提高用藥的有效性與安全性，從而為臨床合理使用泊沙康唑提供參考。目前，關(guān)于國(guó)內(nèi)泊沙康唑血藥濃度監(jiān)測(cè)研究較少，可用于借鑒的方法更少，且檢測(cè)方法多為色譜法。色譜法分析時(shí)間長(zhǎng)，前處理繁瑣，所需血樣量多，污染大，而質(zhì)譜法用于泊沙康唑血藥濃度的檢測(cè)耗時(shí)短，處理簡(jiǎn)單。因此，開(kāi)發(fā)一種適合泊沙康唑血藥濃度檢測(cè)的質(zhì)譜法用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)，就顯得非常重要。本文作了這方面研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器 島津20A高效液相色譜系統(tǒng)(帶自動(dòng)進(jìn)樣器)，配有AB Sciex 4000 QTRAP質(zhì)譜儀，其林貝爾渦旋混合器，全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher)，Analyst V1.5.2工作站(AB公司)。

1.2試劑 甲醇(HPLC-Grade，fisher)、屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏)、甲酸(色譜級(jí)，Mreda Technology INC)、乙酸銨(色譜級(jí)，Mreda Technology INC)、泊沙康唑及泊沙康唑-d4(Standard Refrence Material from qcc.USA)。

1.3方法

1.3.1高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法的液相色譜及質(zhì)譜條件 (1)色譜條件。采用Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×50.0 mm，5 μm)，柱溫50 ℃；進(jìn)樣量3 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸的甲醇溶液；流動(dòng)相B：2 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸的水溶液。流速：0.800 0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，其中0.1～0.2 min，A相水平75%～90%，保持0.2 min，>0.2～0.5 min A相水平75%～90%，保持0.3 min，>0.5～0.9 min A相水平75%，保持2.1 min。(2)質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧電離源(ESI)；離子極性：正離子模式；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓(IS)：5 500.00；溫度：425.00 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)：55；氣體2(GS2，N2)：55；氣簾氣體(CUR，N2)：20；碰撞氣壓力：中等；用于定量分析的離子反應(yīng)為泊沙康唑m/z 701.5～683.4、泊沙康唑-d4 m/z 705.4～687.5。各種質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜條件

1.3.2對(duì)照品貯備液的配制 精確稱取對(duì)照品泊沙康唑10.00 mg，置于小燒杯中，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1 mg/mL泊沙康唑母液，作為貯備液。然后分別用甲醇水(1∶1)依次稀釋母液，泊沙康唑?qū)φ掌匪椒謩e為1、5、10、25、50、75、100 μg/mL，作為系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3樣品處理方法 精密量取標(biāo)本血漿100 μL置于1.5 mL 離心管中，然后加入2 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液100 μL，渦旋振蕩1 min，再加入含有特定水平泊沙康唑-d4的甲醇800 μL，渦旋振蕩1 min，于13 000 r/min離心10 min，取上清液170 μL置于自動(dòng)進(jìn)樣器。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別在7個(gè)1.5 mL 離心管中加入10 μL泊沙康唑各系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，并加入空白血漿90 μL，得到泊沙康唑水平為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10 μg/mL系列質(zhì)量濃度。按“1.3”項(xiàng)中樣品處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，以泊沙康唑峰面積與泊沙康唑-d4峰面積比為(Y)對(duì)泊沙康唑水平(X)進(jìn)行線性回歸，得泊沙康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5回收率、精密度試驗(yàn) 分別在3個(gè)1.5 mL離心管中加入泊沙康唑標(biāo)準(zhǔn)工作液5、10、50 μg/mL各10 μL，并加入空白血漿90 μL，得到泊沙康唑水平為0.5、1.0、5.0 μg/mL的樣品。按“1.3”項(xiàng)中樣品處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，各水平日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算相對(duì)回收率及日內(nèi)精密度，并連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。

1.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在3個(gè)1.5 mL離心管中加入泊沙康唑標(biāo)準(zhǔn)工作液5、10、50 μg/mL各10 μL，并加入空白血漿90 μL，得到泊沙康唑水平為0.5、1.0、5.0 μg/mL的樣品。取1份樣品按“1.3”項(xiàng)中血樣處理方法處理后置于4 ℃冰箱中，于放置時(shí)間為72 h分別測(cè)定各樣品的水平；其余樣品于4 ℃冰箱中放置72 h后取出放至室溫，按“1.3”項(xiàng)中樣品處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，考察其穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1色譜質(zhì)譜行為 在“1.1”項(xiàng)下的色譜、質(zhì)譜條件下，測(cè)得泊沙康唑及泊沙康唑-d4質(zhì)譜圖，見(jiàn)圖1；泊沙康唑及泊沙康唑-d4的色譜圖，見(jiàn)圖2。由圖2可知，血中沒(méi)有物質(zhì)干擾泊沙康唑的測(cè)定，泊沙康唑的保留時(shí)間為2.93 min，峰型良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

圖1 泊沙康唑、泊沙康唑-d4質(zhì)譜圖

注：A為泊沙康唑；B為泊沙康唑-d4

圖2 泊沙康唑及泊沙康唑-d4色譜圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 泊沙康唑的回歸方程：Y=1.11×105X+2.78×103，r=0.993 0，表明泊沙康唑在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，可用于定量檢測(cè)，其最低定量限為0.025 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 泊沙康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果 泊沙康唑的相對(duì)回收率為90%～103%，日內(nèi)及日間精密度均小于5%。見(jiàn)表2。

表2 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4穩(wěn)定性考察結(jié)果 由表3可知，在4 ℃條件下，血中泊沙康唑放置72 h水平無(wú)明顯下降；血樣經(jīng)過(guò)處理后，在4 ℃條件下，泊沙康唑放置72 h水平基本保持不變。由此可以得出，在此條件下測(cè)定血中泊沙康唑水平的穩(wěn)定性良好，能保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5臨床應(yīng)用 收集2015年12月至2016年8月筆者所在醫(yī)院檢測(cè)泊沙康唑血藥濃度的患者血漿標(biāo)本50份，其中男23份，女27份；患者年齡1～66歲。標(biāo)本采集時(shí)間為下次給藥前，采集靜脈血2 mL，混勻，EDTA抗凝。室溫(20～25 ℃)下標(biāo)本存放時(shí)間不超過(guò)4 h，當(dāng)日檢測(cè)。藥物血藥濃度結(jié)果見(jiàn)表4。HPLC-MS/MS法能滿足臨床對(duì)泊沙康唑血藥濃度監(jiān)測(cè)的需求，同時(shí)也可以反映出泊沙康唑臨床應(yīng)用血藥濃度一般不會(huì)太高，很少產(chǎn)生明顯毒性及嚴(yán)重不良反應(yīng)；檢測(cè)中血藥濃度低值較多，達(dá)不到預(yù)防和治療真菌感染的效果。

表4 血藥濃度檢測(cè)結(jié)果(n=50)

3 討 論

泊沙康唑有明顯藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)個(gè)體差異，口服泊沙康唑通過(guò)胃腸道吸收，但吸收具有飽和性?？诜┝啃∮?00 mg時(shí)，其血藥濃度和劑量呈線性關(guān)系，達(dá)到或超過(guò)800 mg 時(shí)吸收程度開(kāi)始顯著降低。泊沙康唑在體內(nèi)的分布很廣泛，口服給藥5～8 h后達(dá)峰值血藥濃度。泊沙康唑的血漿蛋白結(jié)合率很高(98.2%)，主要與清蛋白結(jié)合，所以一般血藥濃度檢測(cè)采用血漿。泊沙康唑幾乎不通過(guò)肝細(xì)胞色素(CYP)酶系代謝，一般通過(guò)葡萄糖醛酸化反應(yīng)代謝，但它可以明顯抑制肝酶CYP3A4的活性，消除半衰期很長(zhǎng)(超過(guò)35 h)，連續(xù)口服給藥后7～10 d達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度[9]。移植患者免疫功能弱，容易感染[9-11]。侵襲性曲霉菌感染是移植患者最危險(xiǎn)的并發(fā)癥之一，病死率高，常推薦口服泊沙康唑預(yù)防該類患者的侵襲性曲霉菌感染[12]，建議其有效水平參考范圍是0.5～5.0 μg/mL。最近研究指出，泊沙康唑用于預(yù)防真菌感染時(shí)，其血藥濃度>0.70 μg/mL，最佳有效濃度靶值為1.25 μg/mL[2-9,13-16]。

本方案檢測(cè)采用紫色試管(EDTA)，需采集約2 mL全血，離心取上清液，通過(guò)甲醇沉淀蛋白和萃取泊沙康唑，使泊沙康唑充分溶解于甲醇中。通過(guò)島津LC-20A高效液相色譜進(jìn)行分離和富集泊沙康唑，用AB Sciex 4000 QTRAP型質(zhì)譜儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)。同時(shí)，選用同位素泊沙康唑-d4作內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行定量，結(jié)果線性良好，回收率高，日內(nèi)、日間精密度符合生物樣本的分析要求，適于臨床應(yīng)用血藥濃度監(jiān)測(cè)。該處理方法簡(jiǎn)單、易操作和重復(fù)性好，避免了批間和樣本間的系統(tǒng)誤差，用于泊沙康唑的母體藥物測(cè)定準(zhǔn)確度高，特異性強(qiáng)[17-18]。