金法祥 許文芳 王曉萌 柳正衛(wèi) 王華鈞 陳雪芳 孫小軍

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染病，是嚴重危害人類健康的慢性傳染病，近10余年來，由于艾滋病、移民和流動人口的增加，以及耐多藥結核病患者的增多，全球結核病防治形勢非常嚴峻[1]。在結核病的發(fā)病率和患病率中, 老年結核病逐年增加, 是結核病疫情流行的一大特征,老年結核病呈高患病率、高發(fā)病率和高病死率，值得引起高度重視[2]。所以，快速診斷老年結核病顯得非常重要。筆者采用結核分枝桿菌及利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增(GeneXpert MTB/RIF)技術、發(fā)光二極管(light emitting diode，LED)熒光染色法和BACTEC MGIT 960系統(tǒng)液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT液體培養(yǎng)”)對老年結核病患者結核分枝桿菌檢測的結果進行比較，以評價3種檢測技術的臨床應用價值。

資料和方法

一、一般資料

收集2013年12月至2015年12月紹興市立醫(yī)院肺科和呼吸感染科收住入院的老年肺結核患者250例，均通過實驗室病原學檢測、影像學和臨床癥狀綜合分析而得到臨床確診。其中，男159例，女91例；年齡65～89歲，平均(70.3±6.2)歲。

二、 試劑與儀器

BACTEC MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)及MGIT分枝桿菌培養(yǎng)管(美國Becton Dickinson公司)；GeneXpert MTB/RIF檢測儀及試劑盒(美國Cepheid公司)，結核分枝桿菌抗原檢測試劑由杭州創(chuàng)新生物技術公司提供；顯微鏡(日本OLYMPUS BX53)、低溫高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific 公司 ST16R)、生物安全柜(上海Heal Force 1200系列)。

三、 研究方法

收集250例患者的晨痰標本3～6 ml，于無菌塑料瓶內(nèi)送檢。每份痰液標本同時進行LED熒光法染色法、MGIT液體培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測。

1. LED熒光染色：涂片、染色、顯微鏡檢查操作參照2009年由中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社出版的《痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》要求進行。熒光染色LED鏡檢標準在暗色背景下，抗酸桿菌呈黃綠色或橙色熒光。鏡檢結果按下列標準報告：(1)抗酸桿菌陰性：0條/50個視野。(2)抗酸桿菌陽性(報告抗酸桿菌數(shù))：1～9條/50個視野。(3)抗酸桿菌陽性(+)：10～49條/50個視野。(4)抗酸桿菌陽性(++)：1～9條/每個視野。(5)抗酸桿菌陽性(+++)：10～99條/每個視野。(6)抗酸桿菌陽性(++++)：100條及以上/每個視野。

2. 分枝桿菌MGIT液體培養(yǎng)：離心管壁標記編號，將標本轉移至離心管中，保證離心管內(nèi)標本體積至少2 ml；加入等體積的N-乙酰-L-半胱胺酸(N-acetyl-L-cysteine，NALC)-NaOH混合溶液；旋緊蓋子，渦旋震蕩消化不超過30 s；室溫靜置15 min；加入0.067 mol的pH為6.8的磷酸鹽緩沖液至40 ml； 3000×g，離心15 min, 溫度控制4 ℃； MGIT分枝桿菌生長培養(yǎng)管(7 ml)中加入0.8 ml的OADC營養(yǎng)添加劑和PANTA雜菌抑制劑的混合試劑。前處理液離心后，將離心管取出，小心棄掉離心管內(nèi)上清液，再加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液至離心管中混勻。吸取0.5 ml前處理后的懸浮液，接種于MGIT液體培養(yǎng)基, 放入BACTEC MGIT 960結核分枝桿菌培養(yǎng)儀。按照說明書進行結果判讀。

3. GeneXpert MTB/RIF檢測：取1 ml標本加入前處理管中，視標本性狀加入2倍SR(樣本處理試劑)標本處理液，渦旋振蕩15～30 s,靜置15 min；取2 ml處理后樣品加入到GeneXpert的反應盒，自動進行PCR檢測所需的3個步驟(樣品核酸提取、擴增和檢測)。采用GeneXpert檢測系統(tǒng)，針對結核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB的81 bp 利福平耐藥核心區(qū)檢測其是否發(fā)生突變。

四、 統(tǒng)計學處理

3種檢測技術計數(shù)資料之間的比較采用χ2檢測，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。GeneXpert MTB/RIF檢測和MGIT液體培養(yǎng)進行一致性檢驗(Kappa檢驗)，K≤0.40時,表示一致性較差；0.40≤K≤0.60時,表示中度一致；0.600.80時,表示二者一致性極好。

結 果

一、LED熒光染色法、MGIT液體培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF的檢測結果

250例痰標本同時采用LED熒光染色法、MGIT液體培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測，總體陽性檢出率分別為36.00%(90/250)，48.40%(121/250)和50.40%(126/250)。GeneXpert MTB/RIF檢測陽性率(50.40%)高于LED熒光染色法(36.00%),二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.56,P<0.01)；高于MGIT液體培養(yǎng)(48.40%)，但二者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.20,P>0.05)；MGIT液體培養(yǎng)陽性率(48.40%)高于LED熒光染色法(36.00%),二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.88,P<0.01)。

二、GeneXpert MTB/RIF 檢測技術檢測MTB的結果

以MGIT液體培養(yǎng)檢測結果為標準, GeneXpert MTB/RIF 檢測技術的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為95.93%(118/123)、93.70%(119/127)、93.65%(118/126)、95.97%(119/124), GeneXpert MTB/RIF 檢測技術和MGIT液體培養(yǎng)法進行Kappa檢驗,K=0.90,兩者具有極好的一致性(表1)。

三、涂陽痰標本GeneXpert MTB/RIF與MGIT液體培養(yǎng)檢測結果比較

涂陽痰標本90例，MGIT液體培養(yǎng)結果陽性85例，陽性率為94.4%；GeneXpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌結果陽性86例，陽性率為95.6%； 2種檢測技術檢出陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.12,P>0.05)

四、涂陰痰標本GeneXpert MTB/RIF與MGIT液體培養(yǎng)檢測結果比較

涂陰痰標本160例，MGIT液體培養(yǎng)陽性36例，陽性率為22.5%； GeneXpert MTB/RIF檢測陽性40例，陽性率為25.0%；2種檢測技術檢出陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.28,P>0.01)。

討 論

結核病細菌學檢測是發(fā)現(xiàn)結核病病原學的主要途徑，是確定結核病診斷及進行抗結核藥物治療的重要依據(jù)。涂片染色方法簡單快速，但敏感度較低[3-4]。老年結核病患者多數(shù)臨床癥狀不明顯, 發(fā)病隱匿,部分出現(xiàn)咳嗽、血痰、胸痛、氣促,常被誤診為慢性阻塞性肺病(COPD)或老年慢性支氣管炎,忽視了痰液和影像學檢查，不能被及時發(fā)現(xiàn),耽誤老年結核病最佳發(fā)現(xiàn)及診斷治療的時機，易誤診或漏診。

本研究結果顯示，3種檢測技術比較，GeneXpert MTB/RIF檢測的陽性率為50.40%，GeneXpert MTB/RIF檢測陽性率高于LED熒光染色法(36.00%),二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.56,P<0.01)；高于MGIT液體培養(yǎng)(48.40%)，但二者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.20,P>0.05)；MGIT液體培養(yǎng)陽性率(48.40%)高于LED熒光染色法(36.00%),二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.88,P<0.01)。

本研究結果顯示，90例涂陽老年結核病患者，MGIT液體培養(yǎng)的陽性率為94.4%；GeneXpert MTB/RIF檢測的陽性率為95.6%，二種方法檢測結果差異無統(tǒng)計學意義。160例涂陰老年結核病患者，MGIT液體培養(yǎng)的陽性率為22.5%； GeneXpert MTB/RIF檢測的陽性率為25.0%，二種方法檢測結果差異無統(tǒng)計學意義。肺結核中老年結核病常見,多為繼發(fā)性肺結核。即以前曾經(jīng)患有肺結核,經(jīng)過治療后病情穩(wěn)定,由于機體免疫力低下等原因引起結核病復發(fā)；老年人自身免疫力低下,加之營養(yǎng)狀況和生活條件等因素，易感染而引起發(fā)??；多年前的結核病沒有根治直接延續(xù)到老年期等[5-6]。

本研究結果顯示，GeneXpert MTB/RIF與MGIT液體培養(yǎng)檢測結果具有高度一致性(K=0.90)。同時GeneXpert MTB/RIF技術可以同時檢測結核分枝桿菌是否對利福平耐藥，其原理主要是檢測結核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB的81 bp核心區(qū)，判斷是否對利福平耐藥[7-12]，因此該技術具有一定的臨床應用價值，優(yōu)勢比較明顯?？傊珿eneXpert MTB/RIF技術是一種快速、方便、特異度強、敏感度高的檢測方法[13]，適合于在各基層結核病防治機構中推廣使用。

表1 GeneXpert MTB/RIF與MGIT液體培養(yǎng)檢測MTB的結果比較

注以MGIT液體培養(yǎng)為標準，得出GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。計算公式如下：敏感度(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%