李強(qiáng) 楊紅國 鄧云峰 歐喜超 夏輝 趙雁林

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)傳染病的第二大死亡原因，仍是全球主要的公共衛(wèi)生問題；根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，近3年來全球結(jié)核病患者從900萬例上升到1040萬例；中國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，每年約有100萬例患者被診斷為結(jié)核病[1]。肺結(jié)核及時(shí)準(zhǔn)確的診斷可迅速啟動(dòng)治療，減少社區(qū)傳播。

抗酸桿菌(AFB)痰涂片顯微鏡鏡檢仍是中低收入國家結(jié)核病診斷的重要方法。在中國，近3000個(gè)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室使用顯微鏡檢查診斷肺結(jié)核[2]。然而，傳統(tǒng)的顯微鏡依賴于人工檢查，檢測的敏感度差異較大[3]。1名熟練的技術(shù)人員對(duì)1份標(biāo)本要花費(fèi)至少5 min來檢查顯微鏡下萋-尼染色涂片的300個(gè)視野。此外，技術(shù)人員在閱讀幾張涂片后通常很容易產(chǎn)生視覺疲勞。為保證顯微鏡檢查的質(zhì)量，1名工作人員不能連續(xù)檢查25張涂片[4]。熒光顯微鏡檢查(FM)鏡下視野小，僅需要檢查50個(gè)視野，可以縮短閱片時(shí)間。因此，F(xiàn)M在工作量大的實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用，以減輕實(shí)驗(yàn)室工作人員的工作強(qiáng)度。此外，F(xiàn)M較萋-尼染色顯微鏡檢查的敏感度高[5]。

在過去的20年中，許多科學(xué)家致力于開發(fā)自動(dòng)顯微鏡閱讀系統(tǒng)，以加快閱片時(shí)間，減少其對(duì)技術(shù)人員的依賴[6-7]?；趫D像分析的自動(dòng)顯微鏡檢查技術(shù)取得一定的進(jìn)步[8]，其步驟通常包括自動(dòng)聚焦、圖像捕獲、圖像分割和對(duì)象分類[9]。自動(dòng)熒光染色和顯微鏡掃描技術(shù)(AFSS)由自動(dòng)染色機(jī)和自動(dòng)掃描顯微鏡系統(tǒng)組成(上海皓信)。顯微鏡受計(jì)算機(jī)控制，由電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)。該系統(tǒng)有4種類型的模塊，包括單片機(jī)和多片機(jī)，可供不同工作量實(shí)驗(yàn)室選擇。AFSS掃描每個(gè)涂片需要2 min。每一個(gè)包含AFB的視野將被保存用于人工復(fù)核。在數(shù)據(jù)庫分析的基礎(chǔ)上，計(jì)算機(jī)通過掃描涂片視野，給實(shí)驗(yàn)人員展示一個(gè)陽性或陰性結(jié)果的典型圖像。為了解AFSS 在地市級(jí)醫(yī)院的臨床表現(xiàn)，筆者在臨沂市人民醫(yī)院開展了本項(xiàng)研究。

材料和方法

1.標(biāo)本來源：2016年9—12月，連續(xù)納入臨沂市人民醫(yī)院門診就診的748例肺結(jié)核可疑癥狀者。747例留取3份痰標(biāo)本，1例留取2份痰標(biāo)本，共計(jì)有2243份標(biāo)本用于本次研究的實(shí)驗(yàn)室檢查。

2.涂片檢查：每一份痰標(biāo)本制作2張涂片， 1張用于傳統(tǒng)熒光染色顯微鏡檢查， 采用40×物鏡。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：陰性 (0條AFB/50 視野)； 實(shí)際條數(shù) (1～9 條AFB/50 視野)； + (10～49條 AFB/50視野)； ++(1～9條 AFB/視野)；+++(10～99條 AFB/視野)；++++ (≥100 條AFB/視野)[10]。

3.自動(dòng)染色涂片掃描：同時(shí)采用另外1張涂片進(jìn)行AFSS自動(dòng)染色和顯微鏡掃描。

4.培養(yǎng)：每份痰標(biāo)本取2 ml痰液用4% NaOH按照 1∶1體積比例混合消化15 min，每個(gè)羅氏固體培養(yǎng)基接種0.1 ml，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8周[11]。9份樣本羅氏固體培養(yǎng)發(fā)生污染，共計(jì)2234份樣本獲得培養(yǎng)結(jié)果。

5.質(zhì)量控制：為保證質(zhì)量，每個(gè)技術(shù)人員在項(xiàng)目研究開始前參加統(tǒng)一技術(shù)培訓(xùn)，培訓(xùn)后開展1周現(xiàn)場預(yù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)期間，所有痰涂片需由1位工作人員應(yīng)用萋-尼染色法復(fù)核[10]。研究現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)室平時(shí)常規(guī)接受上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的質(zhì)量控制檢查。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)錄入Excel表格，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，不同方法檢出率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 AFSS和傳統(tǒng)FM陽性率分析

AFSS檢測陽性率為32.1%，略高于傳統(tǒng)FM顯微鏡檢查31.9%陽性率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05) ，見表1。

二、AFSS和傳統(tǒng)FM檢測結(jié)果對(duì)比分析

AFSS和傳統(tǒng)FM檢測總體一致率為97.1%(2177/2243)，66份樣本檢測結(jié)果有差異。 31份樣本傳統(tǒng)FM檢測為陽性而AFSS檢測為陰性，占AFSS檢測陰性的2.0% (31/1523)， 其中，5份樣本傳統(tǒng)FM檢測結(jié)果為高陽性級(jí)別 (+++和++++)。35份樣本AFSS檢測陽性而傳統(tǒng)FM檢測為陰性，約占傳統(tǒng)FM檢測陰性的2.3% (35/1527)，其中，91.4% (32/35) 的樣本AFSS檢測結(jié)果為低陽性級(jí)別 (實(shí)際條數(shù)和+)，見表2。

三、AFSS及傳統(tǒng)FM檢測不一致者與培養(yǎng)結(jié)果的比較分析

與培養(yǎng)結(jié)果相比較，AFSS檢測陰性而傳統(tǒng)FM檢測陽性的樣本中， 96.8% (30/31) 培養(yǎng)陽性；AFSS檢測陽性而傳統(tǒng)FM檢測陰性的樣本中，54.3% (19/35) 培養(yǎng)陽性(表3)。AFSS檢測陽性而傳統(tǒng)FM檢測陰性且培養(yǎng)陽性的16份樣本， AFSS 檢測結(jié)果均為低陽性級(jí)別(實(shí)際條數(shù)和+)，其中4份樣本萋-尼染色復(fù)核鏡檢結(jié)果為陽性。

表1 2243份痰標(biāo)本采用AFSS和傳統(tǒng)FM檢測的陽性率比較

表2 AFSS和傳統(tǒng)FM檢測結(jié)果對(duì)比分析 (份)

表3 AFSS及傳統(tǒng)FM檢測不一致者與培養(yǎng)結(jié)果的比較分析 (份)

注a：AFSS檢查有6 份標(biāo)本檢測結(jié)果為實(shí)際條數(shù)，9份為+，1份為++；b： FM檢查有4 份為+++，1 份為++++

表4 以羅氏固體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，AFSS和傳統(tǒng)FM檢測分枝桿菌的效能分析

注表中括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“95%CI值”。以痰培養(yǎng)(羅氏固體培養(yǎng))為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算AFSS、傳統(tǒng)FM檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。計(jì)算公式如下：敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%；一致率=(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%

4. AFSS和傳統(tǒng)FM檢測分枝桿菌的效能分析

與固體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，AFSS檢測分枝桿菌的敏感度和特異度分別為83.4%和95.9%，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為91.6%和91.4%。60份AFSS 陽性而培養(yǎng)陰性的樣本中，46份樣本萋-尼染色陽性。131份AFSS陰性而培養(yǎng)陽性樣本中，46份樣本萋-尼染色陽性。傳統(tǒng)FM檢測分枝桿菌的敏感度和特異度分別為84.8%和96.9%。45份傳統(tǒng)FM陽性而培養(yǎng)陰性樣本中，43份樣本萋-尼染色結(jié)果為陽性。120份傳統(tǒng)FM檢測陰性而培養(yǎng)陽性樣本中，29份樣本萋-尼染色結(jié)果為陽性，AFSS 和傳統(tǒng)FM效能分析見表4。

討 論

研究報(bào)道，熒光染色顯微鏡鏡檢的敏感度高于萋-尼染色鏡檢方法[12]。2011年，世界衛(wèi)生組織推薦LED熒光顯微鏡檢查可用于替代傳統(tǒng)萋-尼染色方法[13]。本研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查陽性率為31.9%；AFSS陽性率(32.1%)略高于傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。AFSS和傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查總體一致率為 97.1%，盡管傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查可以檢出更多高陽性級(jí)別樣本，但AFSS可以檢測出更多的低陽性級(jí)別樣本。

本次研究中，AFSS和傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查共有66份樣本檢測結(jié)果不一致，占總樣本量的2.9%。35份傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查陰性樣本AFSS檢測為陽性，占傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查陰性結(jié)果的2.3%。這些樣本中，90%以上樣本AFSS檢測結(jié)果為+或?qū)嶋H條數(shù)，54.3%的樣本最終培養(yǎng)結(jié)果為陽性。另外31份AFSS陰性樣本傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查為陽性，這些樣本幾乎全部培養(yǎng)陽性。不同檢測方法產(chǎn)生不一致檢測結(jié)果可能有幾個(gè)方面原因：首先，臨床上收集的痰標(biāo)本性狀不均勻，制作涂片時(shí)，僅取少量痰樣本，容易導(dǎo)致取樣差異。因此，痰涂片制作過程中取樣差異是造成檢測結(jié)果不一致的最主要原因。其次，與涂片顯微鏡不同，固體培養(yǎng)的關(guān)鍵問題是樣品中存在活細(xì)菌。相反，細(xì)菌的活力對(duì)涂片鏡檢的結(jié)果沒有影響。最后，不同檢測方法檢測原理不同，可能也是導(dǎo)致檢測結(jié)果不一致的原因。

作為一種篩查工具，特異度較敏感度更為重要，可避免漏診可疑患者。本研究結(jié)果顯示，AFSS特異度為95.9%，高于其他研究報(bào)道的自動(dòng)化檢測系統(tǒng)[14]。131份AFSS檢測陰性樣本培養(yǎng)為陽性，其中46份樣本萋-尼染色復(fù)核為陽性。120份傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查陰性樣本培養(yǎng)為陽性，其中29份樣本萋-尼染色復(fù)核為陽性。此外，60份AFSS檢測陽性樣本培養(yǎng)結(jié)果為陰性，45份傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查陽性樣本培養(yǎng)為陰性。AFSS陰性預(yù)測值為91.4%，可能會(huì)漏掉8.6%的培養(yǎng)陽性樣本；而傳統(tǒng)熒光顯微鏡檢查陰性預(yù)測值為92.1%，可能會(huì)漏掉7.9%的培養(yǎng)陽性樣本。結(jié)果提示，AFSS可能會(huì)漏掉一些肺結(jié)核患者，檢測技術(shù)需要做進(jìn)一步改進(jìn)。盡管AFSS檢測技術(shù)和傳統(tǒng)FM檢測的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但AFSS是自動(dòng)化檢測技術(shù)，能夠節(jié)省更多的實(shí)驗(yàn)室人員去開展其他工作，可以提高臨床實(shí)驗(yàn)室的工作效率。

本研究結(jié)果表明，AFSS檢測的陽性率及檢測效能等效于傳統(tǒng)FM檢測技術(shù)，在工作量大的實(shí)驗(yàn)室、特別是人員缺乏的實(shí)驗(yàn)室，AFSS檢測技術(shù)可以作為傳統(tǒng)FM檢查的替代工具。

志謝臨沂市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員及相關(guān)部門人員在患者納入、實(shí)驗(yàn)室檢測和數(shù)據(jù)錄入方面進(jìn)行了大量工作。