馬曉光 鄭丹薇 朱巖昆 石潔 王少華 李輝

結(jié)核病發(fā)病率及發(fā)布例數(shù)一直居于我國(guó)法定報(bào)告乙類(lèi)傳染病的前列；肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的肺部慢性傳染性疾病，嚴(yán)重危害人類(lèi)的身體健康[1-3]。結(jié)核病的病原學(xué)檢測(cè)是結(jié)核病確診和治療的主要依據(jù)，也是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑。目前，我國(guó)肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要依靠痰涂片(染色鏡檢)和痰培養(yǎng)。然而，傳統(tǒng)的痰涂片檢測(cè)敏感度低，且無(wú)法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌[4]，而痰培養(yǎng)方法雖有較高的敏感度和特異度，但檢測(cè)周期長(zhǎng)、易發(fā)生污染，無(wú)法滿(mǎn)足臨床檢測(cè)的實(shí)際需要。因此，尋求簡(jiǎn)便快速、敏感度高、特異度強(qiáng)的檢測(cè)方法成為臨床結(jié)核病診斷的當(dāng)務(wù)之急。本研究采用恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)，對(duì)4276例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本分別進(jìn)行痰涂片、痰培養(yǎng)和恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)。以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析痰涂片和恒溫核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的敏感度、特異度及檢測(cè)時(shí)間，評(píng)價(jià)恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)在基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

由于鄧州市結(jié)核病防治所、永城市結(jié)核病防治所、中牟縣衛(wèi)生防疫站、新密市疾病預(yù)防控制中心等4個(gè)縣級(jí)單位近年來(lái)一直參與結(jié)核病耐藥性監(jiān)測(cè)和“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)的研究，患者資料保存完整和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)完善，因此選取這4個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)進(jìn)行采樣調(diào)查。2014年10月1日至2015年9月30日期間，4個(gè)項(xiàng)目單位共計(jì)納入疑似結(jié)核病患者4336例，按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[5]中的要求收集痰標(biāo)本，每例患者收集3份痰標(biāo)本(即時(shí)痰、夜間痰、晨痰)，涂片后將3份痰標(biāo)本混合后進(jìn)行痰培養(yǎng)和恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)。剔除污染、信息不全、無(wú)臨床診斷結(jié)果等患者，共納入4276例患者的痰標(biāo)本。

二、痰涂片抗酸染色顯微鏡檢查

按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[5]中的要求對(duì)收集的患者痰標(biāo)本進(jìn)行痰涂片、染色和顯微鏡檢操作；萋-尼染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

三、痰標(biāo)本培養(yǎng)

采用簡(jiǎn)單法進(jìn)行痰標(biāo)本的培養(yǎng)。將患者痰液用4%氫氧化鈉消化后，振蕩處理并靜置15 min后，用無(wú)菌一次性吸管接種于改良酸性羅氏培養(yǎng)基上。于37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，第3天和第7天各觀(guān)察1次，此后每周觀(guān)察一次并記錄生長(zhǎng)過(guò)程，培養(yǎng)至菌落生長(zhǎng)或8周后報(bào)告無(wú)菌落生長(zhǎng)。采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定[6]。對(duì)生長(zhǎng)菌落進(jìn)行萋-尼染色，確認(rèn)是否為抗酸桿菌。改良酸性羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

四、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)

痰培養(yǎng)剩余痰液吸取1 ml至帶蓋離心管中，12 000×g離心5 min，去上清；加生理鹽水1 ml，混勻，12 000×g離心5 min，去上清；加入100 μl DNA提取液，渦旋混勻15 s，煮沸10 min；12 000×g離心2 min，將制備好的DNA轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用。按照n+2(n個(gè)待檢樣本+陰性對(duì)照+陽(yáng)性對(duì)照)配制擴(kuò)增液，每管23 μl分裝至PCR管中，將上述含有混勻試劑的PCR管中加入20 μl的密封液，隨后在密封液面以下加入2 μl制備好的DNA及陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，3000×g離心30 s；63 ℃反應(yīng)45 min，由儀器自動(dòng)判讀結(jié)果。恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自廣州迪澳生物技術(shù)有限公司。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)、痰涂片的敏感度和特異度，使用Kappa檢驗(yàn)評(píng)估痰涂片、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)與痰培養(yǎng)的一致率。

六、倫理學(xué)審查

本研究由河南省疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。參與此次研究的患者均簽署知情同意書(shū)，并且整個(gè)研究階段均遵循倫理原則。

結(jié) 果

一、總體檢測(cè)結(jié)果

痰涂片檢出陽(yáng)性者351例，陽(yáng)性檢出率為8.21%(351/4276)；痰培養(yǎng)檢出陽(yáng)性者576例，陽(yáng)性檢出率為13.47%(576/4276)；恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)檢出陽(yáng)性者733例，陽(yáng)性檢出率為17.14%(733/4276)；以上3種檢測(cè)技術(shù)的陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=153.412，P<0.001)。痰培養(yǎng)陽(yáng)性中有34例恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)為陰性，采用噻吩-2羧酸肼(TCH)和對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定，按照《分枝桿菌痰培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》的標(biāo)準(zhǔn)[6]，鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。痰培養(yǎng)陰性中有233例恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)陽(yáng)性，進(jìn)行免疫學(xué)菌種鑒定(MPT64)且與臨床診斷復(fù)核后，確診為肺結(jié)核165例，肺部感染、肺炎等68例。

以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片檢測(cè)的敏感度為57.29%(330/576)，95%的可信區(qū)間為53.12%～61.35%；特異度為99.43%(3645/3666)，95%的可信區(qū)間為99.10%～99.63%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.02%(330/351)，陰性預(yù)測(cè)值為93.68%(3645/3891)；一致率為93.70%，Kappa值為0.679。 恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)法的敏感度為86.81%(500/576)，95%的可信區(qū)間為83.70%～89.40%；特異度為93.64%(3433/3666)，95%的可信區(qū)間為92.79%～94.40%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為68.21%(500/733)，陰性預(yù)測(cè)值為97.83%(3433/3509)；一致率為92.71%，Kappa值為0.722(表1)。痰涂片與恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本的敏感度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=153.336，P<0.001)。

表1 痰涂片、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)

注以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算痰涂片、恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。計(jì)算公式如下：敏感度=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%

二、各縣級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(簡(jiǎn)稱(chēng)“結(jié)防機(jī)構(gòu)”)檢測(cè)結(jié)果分析

對(duì)各個(gè)縣結(jié)防機(jī)構(gòu)采用恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較，鄧州市結(jié)核病防治所該方法檢測(cè)陽(yáng)性率為28.14%；永城市結(jié)核病防治所該方法檢測(cè)陽(yáng)性率為13.71%；中牟縣衛(wèi)生防疫站該方法檢測(cè)陽(yáng)性率為14.36%；新密市疾病預(yù)防控制中心該方法檢測(cè)陽(yáng)性率為12.26%。從表2可以看出，4個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)對(duì)3種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中鄧州市結(jié)核病防治所3種方法的陽(yáng)性檢出率均高于其他3個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)，表明該項(xiàng)目點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力相對(duì)較強(qiáng)。

三、檢測(cè)完成時(shí)間的比較

痰涂片每份樣本一般檢出時(shí)間需要2 h，但檢出率低，從我省數(shù)據(jù)顯示不到13%。雖然痰培養(yǎng)與痰涂片比較可明顯提高陽(yáng)性檢出率，但每份樣本出報(bào)告的時(shí)間較長(zhǎng)，需要將近2個(gè)月。恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)不僅與痰培養(yǎng)相比較具有較高的陽(yáng)性檢出率，而且檢測(cè)時(shí)間較短，和痰涂片檢測(cè)時(shí)間相近，每份樣本檢測(cè)的完成時(shí)間大約為2 h，且可以直接鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，因此在檢測(cè)時(shí)間上與傳統(tǒng)痰涂片和痰培養(yǎng)相比有較大的優(yōu)勢(shì)。

表2 各縣級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)采用3種方法的陽(yáng)性檢出率比較

討 論

結(jié)核病仍是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球約有1/3的人口是結(jié)核分枝桿菌感染者，且大多集中在發(fā)展中國(guó)家；結(jié)核病是成年人單一感染源致死的主要原因[6]。傳統(tǒng)結(jié)核病診斷方法有痰涂片、痰培養(yǎng)。痰涂片操作簡(jiǎn)單、快捷，但對(duì)于含菌量較少的標(biāo)本容易漏檢；痰培養(yǎng)為檢測(cè)分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性檢出率高于痰涂片法，但耗時(shí)較長(zhǎng)，需2～8周才能報(bào)告結(jié)果，且痰涂片與痰培養(yǎng)均不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌。

為了準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，開(kāi)展分子生物學(xué)檢測(cè)已成為發(fā)展趨勢(shì)。比如基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的檢測(cè)、基于分子膜雜交技術(shù)的檢測(cè)，以及基于基因芯片技術(shù)的檢測(cè)等[7-8]，但這些技術(shù)需要較高的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和復(fù)雜的操作技術(shù)，并不適合于基層實(shí)驗(yàn)室的使用。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種檢測(cè)手段，由于具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確，以及擴(kuò)增效率高于普通PCR、檢測(cè)成本低廉等優(yōu)勢(shì)，受到了越來(lái)越多的關(guān)注。并且恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)條件與其他常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法相比，要求比較簡(jiǎn)單[9]。因?yàn)閰⑴c反應(yīng)的嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bst)DNA聚合酶在較寬泛的pH值和溫度范圍內(nèi)，均能保持較好的生物活性，且其對(duì)DNA模板的純度要求較低。所以恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的整個(gè)反應(yīng)體系具有更好的耐受度。近年來(lái)，已有研究者應(yīng)用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行快速診斷和評(píng)估[9-10]。

本研究使用恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)是將恒溫?cái)U(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的快速核酸擴(kuò)增和自動(dòng)化結(jié)果報(bào)告。該方法作為一種全新的體外快速診斷技術(shù)，通過(guò)Bst DNA聚合酶及結(jié)核特異性核酸片段的特異性引物，在恒溫條件下對(duì)樣本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的核酸片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物(DNA)與核酸染料結(jié)合后發(fā)出熒光信號(hào)，通過(guò)實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)判讀檢測(cè)結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，該方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)的敏感度為86.81%，特異度為93.64%，并且該方法與痰培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果的Kappa值為0.722，說(shuō)明其與痰培養(yǎng)結(jié)果比較具有非常好的一致性。同時(shí)4個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)的數(shù)據(jù)顯示恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)與痰涂片和培養(yǎng)相比，明顯提高了陽(yáng)性檢出率。由于該方法具有較好的敏感度和特異度，并且操作簡(jiǎn)單、生物安全性高、檢測(cè)過(guò)程不易受干擾，因此可在基層實(shí)驗(yàn)室作為快速檢測(cè)技術(shù)用于結(jié)核病的診斷。