聶曉平 李桓 楊洪英 羅明 楊國強 周刊 黃正谷 王鵬森 廖傳玉 張匯征 周剛 陳玉 陳耀凱 石濤 李同心

結(jié)核病是一種長期危害人類身體健康的慢性傳染病，其臨床表現(xiàn)多樣，其中80%發(fā)生在肺部，其他部位(頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼等)也可繼發(fā)感染[1]。WHO[2]在《2015年全球結(jié)核病報告》中指出，我國2014年臨床確診近53萬例新發(fā)患者中有3.2萬例肺外結(jié)核患者。肺外結(jié)核由于病變部位廣泛、臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，早期診斷和鑒別診斷較為困難。

快速、敏感的實驗室檢測技術(shù)是輔助臨床提高肺外結(jié)核早期診斷的重要手段。實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing，SAT)是近年來我國結(jié)核實驗室使用的分子生物學(xué)檢測方法之一，主要用于檢測痰液里的結(jié)核分枝桿菌(MTB)來輔助診斷肺結(jié)核患者[3-9]。為了明確SAT用于重慶區(qū)域肺外結(jié)核輔助診斷的臨床價值和意義，本研究對該類患者樣本采用SAT、羅氏培養(yǎng)和液體培養(yǎng)(以下兩種培養(yǎng)方法簡稱“培養(yǎng)法”)同步檢測并比較結(jié)果，評估其敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標(biāo)。

資料和方法

一、研究對象、試驗儀器及試劑

1.標(biāo)本來源：連續(xù)收集重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心結(jié)核科、普通外科與骨科2016年1月至2017年12月期間收治482例患者的送檢標(biāo)本(主要為病變部位的膿液或手術(shù)取出物)；含433例肺外結(jié)核(作為試驗組)和49例排除結(jié)核病的其他疾病(作為對照組)，全部患者均由結(jié)核?？漆t(yī)生臨床確診，診斷肺外結(jié)核和排除結(jié)核病參照文獻(xiàn)[10-14]，診斷不明確的不納入本研究。其中，男259例，女223例，年齡范圍7～79歲，平均年齡(35.5±17.1)歲， 12例患者臨床血液檢測HIV抗體為陽性。對照組49例患者中有10例頸部淋巴結(jié)炎，6例胸膜炎，6例膝關(guān)節(jié)炎，6例腰椎融合術(shù)后，5例膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后，4例液氣胸，3例腹股溝膿腫，3例腋窩淋巴結(jié)炎，2例肛周膿腫，2例踝關(guān)節(jié)炎，2例心包積液，1例睪丸鞘膜積液。本研究均取得患者知情同意和重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心學(xué)術(shù)倫理委員會同意。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)參考菌株(H37Rv)來源于中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室。

2.主要儀器及試劑來源：本研究使用的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)、雜菌抑制劑(PAN-TA)、分枝桿菌培養(yǎng)管(MGIT)及營養(yǎng)添加劑(OADC)均來源于美國BD公司。BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀來源于美國伯樂公司。中性改良羅氏培養(yǎng)基購于珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司。結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴增法，商品名為“TB-SAT”)購于上海仁度生物科技有限公司。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸提取、檢測試劑盒(實時熒光PCR法)和Lab-Aid 824型自動核酸提取儀購于廈門致善生物科技股份有限公司。分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒購于亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司。

二、方法

1.標(biāo)本采集：患者病變部位的膿液或手術(shù)過程中取出物由臨床醫(yī)生留取，低溫保存，及時送檢。

2.標(biāo)本前處理：標(biāo)本前處理按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[15]堿處理-中和離心沉淀法的要求進(jìn)行，離心后的沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，均等分為3份，留1份于-20 ℃?zhèn)溆茫?份分別用于結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)和TB-SAT檢測。

3.標(biāo)本分離培養(yǎng)：取1份重懸液，按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[15]和BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)操作說明書將PBS重懸后的沉淀物同步接種于MGIT和中性羅氏培養(yǎng)基。結(jié)果記錄參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[15]。本研究中以上2種培養(yǎng)方法任意一種結(jié)果為陽性，即視為樣本培養(yǎng)結(jié)果為陽性。

4.標(biāo)本TB-SAT檢測：取一份重懸液按照TB-SAT 試劑說明書操作，具體步驟：離心半徑8.8 cm，13 000 r離心 5 min ，棄上清，再用1 ml無菌生理鹽水洗滌1次后加入50 μl TB裂解液重懸，超聲(功率300 W)處理15 min。取樣前，離心半徑8.8 cm，10 000 r 離心 2 min。取2 μl離心后樣本上清液加入含30 μl擴增檢測液的微量反應(yīng)管中，將微量反應(yīng)管置于干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min，再置于42 ℃保溫5 min，同時將反應(yīng)酶預(yù)熱至42 ℃，最后向每支反應(yīng)管中加入10 μl反應(yīng)酶，迅速混勻并轉(zhuǎn)至實時熒光定量PCR儀。反應(yīng)程序：熒光通道設(shè)定為羧基熒光素(FAM)，每個循環(huán)為42 ℃、1 min，共40個循環(huán)；熒光信號收集1次/min，共檢測40次。閾值設(shè)定：以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性判斷值(dt)≤35的樣本為陽性；dt為35～40的樣本建議重新檢測，重測結(jié)果dt<40為陽性；dt無數(shù)值或為40的樣本為陰性。質(zhì)量控制：每次檢測都必須做陰性和陽性對照，且陽性對照dt≤35，陰性對照無數(shù)值或為40，否則需重復(fù)試驗。

5.MTB鑒定：對培養(yǎng)法和TB-SAT結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行MTB鑒定。取備用的重懸液按照廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸提取、檢測試劑盒(實時熒光PCR法)說明書進(jìn)行DNA提取和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定。

6.分枝桿菌菌種鑒定：對培養(yǎng)法陽性、TB-SAT結(jié)果陰性的樣本，進(jìn)一步對培養(yǎng)陽性的菌株進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。按照亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒說明書，采用反向點雜交法進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

醫(yī)院信息系統(tǒng)(hospital information system，HIS；為上海瑞美電腦科技有限公司產(chǎn)品)檢索統(tǒng)計患者病歷信息，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。分別與培養(yǎng)法、患者臨床診斷比較，計算SAT檢測方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。培養(yǎng)法和SAT檢測MTB的陽性率比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TB-SAT與培養(yǎng)法MTB檢測結(jié)果比較

本研究共納入433例肺外結(jié)核患者的標(biāo)本：127例培養(yǎng)法陽性的標(biāo)本中TB-SAT檢測結(jié)果為陽性者有107例，陰性結(jié)果有20例；306例培養(yǎng)法陰性的患者中TB-SAT檢測結(jié)果為陽性者有73例，陰性結(jié)果有233例。49例對照組樣本中有1例標(biāo)本為培養(yǎng)法陽性、TB-SAT檢測結(jié)果陰性，其余48例標(biāo)本培養(yǎng)法與TB-SAT檢測結(jié)果均為陰性。試驗組培養(yǎng)法的陽性檢出率為29.3%(127/433)，TB-SAT 陽性檢出率為41.8%(181/433)；對照組培養(yǎng)法陽性檢出率為2.0%(1/49)，TB-SAT陽性檢出率為0.0%(0/49)。試驗組TB-SAT與培養(yǎng)法兩者的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=30.20 ，P<0.05)，對照組TB-SAT與培養(yǎng)法兩者的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.00 ，P>0.05)，見表1。

以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，則TB-SAT檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為83.6%(107/128)、79.4%(281/354)、59.4%(107/180)、93.0%(281/302)、83.6%(107/128)。以臨床診斷作為標(biāo)準(zhǔn)，則培養(yǎng)法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為29.3%(127/433)、98.0%(48/49)、99.2%(127/128)、13.6%(48/354)、36.3%(175/482)；TB-SAT檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為41.6%(180/433)、100.0%(49/49)、100.0%(180/180)、16.2%(49/302)、47.5%(229/482)，詳見表2。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，兩種方法檢測陽性率培養(yǎng)法為29.3%(127/433)，SAT法為41.6%(180/433)(χ2=14.17，P<0.05)。

表1 兩組患者分別采用TB-SAT與培養(yǎng)法的檢測陽性率比較

表2 兩組患者TB-SAT與培養(yǎng)法檢測結(jié)果及以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)對兩種方法檢測結(jié)果的比較

注各項指標(biāo)定義：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性人數(shù))×100%，特異度度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性人數(shù))/總例數(shù)×100%

二、TB-SAT與培養(yǎng)法檢測結(jié)果不一致的樣本MTB鑒定結(jié)果

482例樣本中TB-SAT與培養(yǎng)法檢測結(jié)果不一致的樣本有94例，其中TB-SAT檢測結(jié)果陽性、培養(yǎng)法檢測結(jié)果陰性的樣本有73例(均來自試驗組)；TB-SAT檢測結(jié)果陰性、培養(yǎng)法檢測結(jié)果陽性的樣本有21例(僅1例來自對照組)。對兩種檢測方法結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行MTB鑒定，結(jié)果顯示：試驗組73例TB-SAT檢測結(jié)果陽性，培養(yǎng)法檢測結(jié)果陰性的樣本中MTB鑒定結(jié)果陽性有70例，陰性有3例；試驗組20例TB-SAT檢測結(jié)果陰性、培養(yǎng)法檢測結(jié)果陽性的樣本中MTB鑒定結(jié)果陽性有3例，陰性有17例。1例對照組TB-SAT檢測結(jié)果陰性、培養(yǎng)法檢測結(jié)果陽性的樣本MTB鑒定結(jié)果為陰性。

三、分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果

TB-SAT結(jié)果陰性、培養(yǎng)法陽性的菌株有21株(例)，分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果顯示：3株(例)為胞內(nèi)分枝桿菌，1株(例)為龜分枝桿菌膿腫亞種，1株(例)為戈登分枝桿菌，其余16株(例)為MTB(含試驗組3例TB-SAT檢測結(jié)果陰性、培養(yǎng)法檢測結(jié)果陽性且MTB鑒定結(jié)果陽性的樣本)。

討 論

SAT是將新一代的核酸恒溫擴增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)原理：同一溫度下，首先通過莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus) 逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT)產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(100～1000個)RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光，該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴增循環(huán)情況。近年來該技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床檢測痰液中的MTB，以早期診斷肺結(jié)核，但用于檢測肺外結(jié)核的臨床價值報道少見。

本研究同步采用羅氏培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法和SAT三種方法檢測肺外結(jié)核標(biāo)本MTB，共納入482例患者，研究結(jié)果較客觀、準(zhǔn)確。以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，則TB-SAT檢測的敏感度、特異度分別為83.6%(107/128)、79.4%(281/354)，兩種方法符合率為83.6%(107/128)。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，則培養(yǎng)法的敏感度、特異度分別為29.3%(127/433)、98.0%(48/49)；TB-SAT檢測的敏感度、特異度分別為41.6%(180/433)、100.0%(49/49)。多數(shù)文獻(xiàn)報道，SAT應(yīng)用于檢測痰液中MTB的敏感度在37.6%～56.5%之間[16-19]；方法相同，卻有一定的差異。Fan等[20]研究者認(rèn)為，差異與痰標(biāo)本的處理、運輸和局灶性肺結(jié)核等原因有關(guān)，與方法本身關(guān)系不大。以臨床診斷作為標(biāo)準(zhǔn)，本研究SAT檢測的特異度為100.0%(49/49)，高于培養(yǎng)法的特異度[98.0%(48/49)]，主要由于SAT檢測陽性結(jié)果可以排除NTM的單一感染或確定MTB感染；SAT和培養(yǎng)法均不能區(qū)分同一患者M(jìn)TB和NTM的混合感染。SAT一般可在2 h內(nèi)完成，培養(yǎng)耗時較長，當(dāng)SAT和痰涂片結(jié)果均為陽性，不需要等待培養(yǎng)結(jié)果即可及時明確患者是否感染MTB。本研究SAT陰性預(yù)測值較低，提示臨床醫(yī)生不能依據(jù)該檢測結(jié)果排除結(jié)核病，臨床上仍需要借助其他檢查結(jié)果以明確診斷。

羅氏培養(yǎng)法檢測分枝桿菌是傳統(tǒng)且經(jīng)典的實驗室方法，長期以來被認(rèn)為是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，通常其檢測結(jié)果也作為評估新MTB檢測試劑的金標(biāo)準(zhǔn)?？紤]分枝桿菌自身活力、L型，以及羅氏培養(yǎng)基營養(yǎng)條件等因素影響，本研究采用羅氏培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法同時檢測標(biāo)本，以期提高培養(yǎng)法檢測結(jié)果的敏感度。實時熒光PCR法檢測MTB核酸試劑有著較高的敏感度和特異度，當(dāng)SAT與培養(yǎng)法檢測結(jié)果不一致時，本研究采用另一種實時熒光PCR檢測試劑進(jìn)行評價。也有大型隊列研究進(jìn)一步分析了SAT檢測方法的敏感度，當(dāng)檢測結(jié)果不一致時，進(jìn)行一次SAT重復(fù)檢測，其檢測敏感度可達(dá)75.8%[21]。本研究對94例TB-SAT與培養(yǎng)法檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)行MTB鑒定，TB-SAT與實時熒光PCR法一致率為92.6%(87/94)。為了進(jìn)一步證實前述各方法的一致性，本研究對21例TB-SAT 結(jié)果陰性、培養(yǎng)法陽性的菌株進(jìn)行了分枝桿菌菌種鑒定，結(jié)果顯示僅有5例為NTM，另16例為MTB，占76.2%(16/21)，即臨床上不能忽視SAT陰性而培養(yǎng)陽性的患者感染MTB的可能性。3例TB-SAT結(jié)果陰性、培養(yǎng)法陽性而MTB鑒定為陽性，分析原因可能標(biāo)本中含有影響TB-SAT 擴增反應(yīng)的雜質(zhì)，或者非痰液樣本(如膿液、組織等)的特殊成分構(gòu)成導(dǎo)致樣本中MTB分布不均，或樣本中MTB菌量較少、裂解液中模板分布不均勻等。73例培養(yǎng)法陰性、TB-SAT陽性的樣本經(jīng)PCR法鑒定，結(jié)果顯示70例TB-SAT與PCR法均為陽性，占95.9%(70/73)；另3例培養(yǎng)陰性、TB-SAT 陽性、PCR法為陰性的樣本沒有進(jìn)一步試驗證實，這也是研究的不足之處。

SAT除了具有反應(yīng)穩(wěn)定、敏感度與特異度較高等優(yōu)點外，該技術(shù)實驗室反應(yīng)條件簡單，操作簡便，不需要溫度循環(huán)，其擴增效率高，反應(yīng)時間短；RNA擴增產(chǎn)物和模板均為RNA，RNA容易降解，可大大減少實驗室污染。

綜上所述，TB-SAT檢測是一項簡便快速、敏感度和特異度較培養(yǎng)法高的結(jié)核病檢測方法，臨床上可應(yīng)用于輔助診斷肺外結(jié)核，同時可在一定程度上提高培養(yǎng)陰性肺外結(jié)核患者的陽性檢出率。