劉浩然 張亞莉 任衛(wèi)聰 趙玲娟 李傳友 王偉 高孟秋

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病，是全球共同關(guān)注的嚴(yán)峻問題。WHO[1]2016年數(shù)據(jù)顯示，我國肺結(jié)核發(fā)病例數(shù)位居世界第三。肺結(jié)核的臨床確診依賴于細(xì)菌學(xué)的檢測，如痰涂片及痰培養(yǎng)等，但臨床上菌陰肺結(jié)核患者的比例較高。菌陰肺結(jié)核患者的臨床診斷目前主要依賴于影像學(xué)表現(xiàn)、臨床癥狀及血清標(biāo)志物水平的變化等進(jìn)行綜合評價[2]。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，是中國乃至全世界最常見的惡性腫瘤及首位的癌癥死亡原因。肺癌的臨床診斷主要依賴于穿刺活檢、痰脫落細(xì)胞等病理學(xué)相關(guān)檢測，但在臨床上有時很難得到病理學(xué)證據(jù)這一肺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，使肺癌的診斷變得更加困難，導(dǎo)致肺癌與肺結(jié)核常難以鑒別[3]。在區(qū)分結(jié)核性胸腔積液及肺癌性胸腔積液時，其診斷仍主要依賴于胸腔積液中的細(xì)菌學(xué)及病理學(xué)證據(jù)，依舊存在著檢出率低、敏感度低等問題?？梢娺M(jìn)一步探索、發(fā)現(xiàn)可以有效區(qū)分肺結(jié)核及肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物就顯得尤為重要。

巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種多功能的細(xì)胞因子，在肺結(jié)核中MIF具有抑制巨噬細(xì)胞游走、調(diào)節(jié)固有免疫反應(yīng)等多種功能，發(fā)揮重要的抗結(jié)核作用[4]；在肺癌中MIF對肺癌細(xì)胞的增殖及凋亡產(chǎn)生重要的影響，在肺癌的進(jìn)展中發(fā)揮諸多調(diào)節(jié)作用[5]。維甲酸相關(guān)孤兒核受體α(RAR-related orphan receptor alpha，RORα)及維甲酸相關(guān)孤兒核受體γ(RAR-related orphan receptor gama，RORγ)是孤兒核受體家族中的重要成員，二者可以結(jié)合DNA并參與到轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控中，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育，同時在機體抗結(jié)核的免疫反應(yīng)中發(fā)揮多種調(diào)控作用[6-8]。

機體在受到結(jié)核分枝桿菌感染后，巨噬細(xì)胞會產(chǎn)生并分泌MIF，發(fā)揮一定的抗結(jié)核作用。 Das 等[9]的研究證實了MIF在機體抗結(jié)核的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，以及殺菌抑菌作用。另有一些研究發(fā)現(xiàn)，MIF在肺癌患者肺組織中的過度表達(dá)能夠增強癌細(xì)胞的活性，這可能與腫瘤的演化進(jìn)展密切相關(guān)[10-11]?？梢姡琈IF在不同疾病狀態(tài)下發(fā)揮著不同的作用，其表達(dá)水平也很可能存在著一定差異。同樣有研究發(fā)現(xiàn)[12]，RORα及RORγ在肺結(jié)核與肺癌中存在著轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異。

可見MIF、RORα及RORγ在肺結(jié)核及肺癌患者中均有表達(dá)，而3種細(xì)胞因子在肺結(jié)核和肺癌患者之間的表達(dá)水平可能存在著一定差異。本次研究筆者檢測了肺癌和肺結(jié)核患者胸腔積液中上述3種蛋白的水平，探索3種細(xì)胞因子在肺結(jié)核與肺癌患者胸腔積液中的表達(dá)情況，從免疫學(xué)的角度對3種細(xì)胞因子進(jìn)行比較分析，并且評價了各自在肺結(jié)核及肺癌鑒別診斷中的價值。

材料和方法

1. 研究對象：所有納入研究患者的樣本均為凍存胸腔積液，全部取自北京胸科醫(yī)院，具有完整的患者病歷資料。查閱2010年至2018年病歷資料，對所有確診為繼發(fā)性肺結(jié)核及肺癌患者的胸腔積液樣本進(jìn)行編號，通過簡單隨機抽樣[13]，選取肺結(jié)核及肺癌患者胸腔積液標(biāo)本各80例。其中，肺結(jié)核組男51例(63.75%)、女29例(36.25%)，年齡范圍18～81歲、平均年齡(46.90±20.03)歲；肺癌組男59例(73.80%)、女21例(26.30%)，年齡范圍29～83歲、平均年齡(60.84±11.72)歲(表1)。兩組間性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.86，P>0.05)；肺結(jié)核組與肺癌組患者的年齡分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.37，P<0.01)，肺癌組年齡分布高于肺結(jié)核組。

表1 患者一般特征在兩組中的分布

注表中括號外數(shù)值為“患者例數(shù)”，括號內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”

2. 樣本量估算：通過預(yù)試驗結(jié)果進(jìn)行樣本量的估算，使用兩獨立總體樣本量估算公式進(jìn)行計算[13]，得到兩組最低納入樣本量為46例，為保證本研究的科學(xué)性，故將各組納入樣本例數(shù)定位80例。

3. 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺結(jié)核組。痰細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果陽性，包括痰涂片陽性或痰培養(yǎng)陽性，并且符合臨床肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]，同時患者具有胸腔積液。(2)肺癌組。有肺癌的病理學(xué)證據(jù)，并且符合肺癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]，同時患者具有胸腔積液。

4. 排除標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均排除患有自身免疫性疾病、肝腎疾病、過敏性疾病等。同時排除采樣時3個月內(nèi)患過肺炎或服用特殊藥物(如糖皮質(zhì)激素等)者。

5. 檢測方法：所有胸腔積液標(biāo)本室溫解凍后離心取上清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測標(biāo)本中的MIF、RORα及RORγ濃度。采用武漢華美生物工程的ELISA試劑盒。

結(jié) 果

1. 兩組患者胸腔積液中MIF、RORα及RORγ檢測水平的比較：肺結(jié)核組患者胸腔積液MIF、RORα及RORγ檢測水平[M(Q1，Q3)]分別為5.83(2.41，16.43)、0.63(0.37，1.66)和3.23(1.82，5.26) ng/L；肺癌組患者胸腔積液MIF、RORα及RORγ檢測水平分別為2.79(0.91，11.12)、0.63(0.57，2.16) 和3.44(1.94，7.11) ng/L(表2)。各組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(Mann-WhitneyU檢驗)。肺結(jié)核組患者胸腔積液MIF檢測水平[5.83(2.41，16.43) ng/L]高于肺癌患者組[2.79(0.91，11.12) ng/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=2314.50，P<0.01)。但胸腔積液中RORα及RORγ檢測水平在兩組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(U值分別為3525.00、3431.50，P值均>0.05)。3種細(xì)胞因子的表達(dá)水平散點圖具體見圖1。

2. 受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析：采用ROC曲線分析鑒別診斷結(jié)核性和肺癌性胸腔積液的最佳界值，通過檢測胸腔積液中MIF水平的ROC曲線下面積為0.64，具有一定的診斷價值(圖2)。當(dāng)尤登指數(shù)(敏感度+特異度-1)[13]取最大值0.28時，MIF水平的鑒別診斷結(jié)核性與肺癌性胸腔積液的界限值為2.01 ng/L，此時敏感度為82.50%、特異度為45.00%。

討 論

肺結(jié)核及肺癌均是威脅人類生命健康的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，兩者的臨床表現(xiàn)有時難以區(qū)分。兩種疾病均可使患者產(chǎn)生胸腔積液，而胸腔積液成分的差異可以對區(qū)分兩種疾病起到一定的提示作用。

本研究發(fā)現(xiàn)MIF在結(jié)核性胸腔積液中的水平要高于肺癌性胸腔積液，并且胸腔積液中的MIF水平可以在一定程度上輔助對兩種疾病進(jìn)行鑒別診斷，但其不足在于診斷效能仍較低，敏感度及特異度均不高，具有一定的鑒別診斷價值。為進(jìn)一步提高其診斷效能，可以將胸腔積液中MIF的表達(dá)水平與其他已有意義于臨床的血清學(xué)生物標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合分析，構(gòu)建新的聯(lián)合診斷模型，這可能有助于提高診斷的敏感度及特異度。

表2 肺結(jié)核及肺癌患者胸腔積液中MIF、RORα和RORγ檢測水平的比較

注各組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(Mann-WhitneyU檢驗)

圖2 胸腔積液檢測MIF表達(dá)水平鑒別診斷肺結(jié)核及肺癌的ROC曲線

Espósito等[12]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸腔積液中RORα及RORγ的轉(zhuǎn)錄水平較肺癌性胸腔積液中的水平高。而在本研究中，通過ELISA方法檢測兩種疾病胸腔積液中的RORα及RORγ的蛋白水平并未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。雖然兩種受體在轉(zhuǎn)錄水平上有差異，但在蛋白水平上可能尚未發(fā)生明顯變化。本次實驗中，在兩組患者的胸腔積液中均檢測出了較低水平的RORα及RORγ表達(dá)，這可能是由于胸腔積液中巨噬細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的死亡及破裂，使兩種核受體游離到胸腔積液中而被檢測到。另外，改進(jìn)實驗方法，如裂解胸腔積液中的細(xì)胞后再進(jìn)行上述細(xì)胞因子的檢測等，可能有助于提高檢測結(jié)果的敏感程度，但仍需進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗證分析。

綜上所述，肺結(jié)核患者胸腔積液中的MIF水平較肺癌患者更高，胸腔積液中MIF的水平在一定程度上有助于對肺結(jié)核與肺癌患者進(jìn)行鑒別診斷；而兩組患者胸腔積液檢測RORα及RORγ的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，仍有待做進(jìn)一步的研究。但本研究樣本量較少，并且沒有進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平等其他層面的驗證分析，在一定程度上對結(jié)果的精確性可能產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步做更大樣本和更深入的研究。