樊曉東 陸興熱 張成偉 張青 資云菊 袁雕 葉樹櫻 王武滿 朱德永 楊生仙 文山州人民醫(yī)院 （云南 文山 663099）

內(nèi)容提要： 目的：探討金胺“O”熒光集菌染色法在檢測(cè)痰液中抗酸桿菌的臨床應(yīng)用，為肺結(jié)核的早期快速診斷、治療提供參考依據(jù)。方法：選擇212例2016年6月～2017年12月感染科收治的疑似肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，對(duì)其痰標(biāo)本采取直接涂片和離心集菌涂片兩種制片方法，用萋-尼氏抗酸染色法和金胺"O"熒光法進(jìn)行染色鏡檢。結(jié)果：直接涂片抗酸染色法陽性率（9.43%，20/212）低于集菌涂片抗酸染色法（13.68%，29/212），直接涂片金胺“O”熒光染色法陽性率（17.45%，37/212）低于集菌涂片金胺“O”熒光染色法（36.32%，77/212），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.62，12.37，P=0.02，0.00）。集菌涂片抗酸染色法陽性率（13.68%，29/212）低于集菌涂片金胺“O”熒光染色法（36.32%，77/212），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.65，P=0.00）。金胺“O”熒光染色法的敏感度，特異性，約登指數(shù)及陽性、陰性預(yù)測(cè)值均優(yōu)于萋-尼氏抗酸桿菌染色法，差異有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論：金胺“O”熒光集菌染色法是一種檢測(cè)靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、快速的方法，對(duì)結(jié)核病患者的早期診斷和治療具有重要意義。

結(jié)核病大部分就是肺結(jié)核，被視為威脅人民群眾身體健康的傳染病。現(xiàn)如今，我國每年新發(fā)結(jié)核病患者就占到了90萬例，作為一個(gè)全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，在全球占到了第3位[1]。在我國，肺結(jié)核病人的診斷中廣泛的應(yīng)用了痰標(biāo)本直接涂片法，該路徑價(jià)格低廉、操作起來較為簡(jiǎn)單。同時(shí)也出現(xiàn)了其他的新方法，萋-尼氏抗酸染色法的特點(diǎn)就是陽性檢出率低、鏡檢時(shí)間長；金胺“O”熒光染色的特點(diǎn)就是操作方便簡(jiǎn)單、極易分辨、時(shí)間短等。本研究借助金胺“O”熒光染色法以及抗酸染色法對(duì)疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本展開檢測(cè)，對(duì)痰標(biāo)本中抗酸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，給予臨床應(yīng)用依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

212 例標(biāo)本來源于2016年6月～2017年12月感染科收治的疑似肺結(jié)核患者，入組樣本為患者持續(xù)咳嗽、咳痰3周以上，有咯血或伴有血痰；發(fā)熱或胸痛超過2周；胸部X線顯示異常，臨床診斷高度懷疑為肺結(jié)核病人的晨痰標(biāo)本。合格痰標(biāo)本應(yīng)為血性、膿性、干酪樣及黏液性痰，標(biāo)本量≥2mL。其中男49例，女45例，年齡20～67歲，平均（45.9±12.3）歲。每份痰標(biāo)本制備4張?zhí)低科渲?張為直接痰涂片，2張為次氯酸鈉液化離心沉淀集菌痰涂片。分為抗酸染色組和熒光染色組，每組由1張直接痰涂片和1張集菌痰涂片組成。

1.2 儀器與試劑

金胺“O”熒光染色液、萋-尼氏抗酸染液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供、生物顯微鏡、日本奧林巴斯熒光顯微鏡、上海復(fù)星生物安全柜、清潔無油脂新玻片。

1.3 方法

借助竹簽，將痰標(biāo)本中膿樣、干酪樣或者血性挑取部分，大約0.05～0.1mL，在玻片正面右側(cè)2/3中央處，均勻涂抹成痰膜朝上、厚薄適中的一個(gè)10mm×20mm的卵圓形痰膜，在生物安全柜中靜置，打開紫外線燈照射15min（滅菌），室溫下干燥后將痰涂片火焰固定。將剩余痰標(biāo)本加等體積的5%次氯酸鈉溶液，混勻后靜置30min（液化、滅菌）[2]，倒入潔凈離心試管中，震蕩混勻后用離心機(jī)4000r/轉(zhuǎn)離心15min[3]，去上清，留1mL沉渣混勻制成2張集菌痰涂片，涂片方法同直接涂片法。剩余沉渣保留備用。將制備好的痰涂片進(jìn)行染色和鏡檢。①染色方法：染色嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行?？顾崛旧M：將已固定的痰涂片滴加石碳酸復(fù)紅溶液初染10min；水洗，瀝水后滴加酸性酒精脫色1～2min或至無色；水洗，瀝水后滴加亞甲基藍(lán)溶液復(fù)染30s，水洗，晾干待檢。熒光染色組：涂片固定后加金胺“O”染色液室溫初染15min，水洗，瀝水后用酸性酒精脫色1～2min或至無色，水洗，瀝水后用高錳酸鉀復(fù)染液復(fù)染3min，水洗晾干待檢；②鏡檢：抗酸染色組：染色好的痰涂片用OLYMPUS CX21普通光學(xué)顯微鏡觀察。用40×物鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，使用100×油鏡觀察細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，每個(gè)標(biāo)本仔細(xì)觀察300個(gè)視野。熒光染色組：已染好的痰涂片用OLYMPUS熒光落射暗視野顯微鏡觀察，鏡檢使用的是10×目鏡、20×物鏡，若是出現(xiàn)疑為抗酸桿菌的熒光桿狀的物質(zhì)，借助40×物鏡展開確認(rèn)。需要依據(jù)《中國結(jié)核病防治規(guī)劃·痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》來確保涂片鏡檢的質(zhì)量，同時(shí)依據(jù)相關(guān)的程序和頻度來實(shí)施[4]。痰涂片保存需要超過1年，以便上級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室展開接下來的質(zhì)量控制復(fù)驗(yàn)?？顾釛U菌陽性：抗酸桿菌陽性（1+）：3～9條/100視野；抗酸桿菌菌數(shù)1～8條/300視野；抗酸桿菌陽性（2+）：1～9條/10視野；抗酸桿菌陽性（3+）：1～9條/1視野；抗酸桿菌陽性（4+）：≥10條/1視野。報(bào)告1+時(shí)至少觀察300個(gè)視野，報(bào)告2+至少觀察100個(gè)視野，3+、4+時(shí)至少觀察50個(gè)視野。萋-尼氏抗酸桿菌染色鏡檢結(jié)果分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：萋-尼氏染色抗酸桿菌陰性：對(duì)300個(gè)不同視野進(jìn)行連續(xù)觀察，沒有出現(xiàn)抗酸桿菌；熒光染色鏡檢結(jié)果分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)：熒光染色抗酸桿菌陰性（-）：0條/50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（報(bào)告抗酸桿菌數(shù)）：1～9條/50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（3+）：10～99條/1視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（4+）：100條及以上/1視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（2+）：1～9條/1視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（1+）：10～49條/50視野。報(bào)告2+至少觀察50個(gè)視野，3+及以上的陽性結(jié)果至少觀察20個(gè)視野。

表1. 集菌涂片抗酸染色法法及金胺“O”熒光染色法三維卡方檢驗(yàn)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

按照萋-尼氏抗酸桿菌染色和熒光染色鏡檢結(jié)果分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種方法檢出的陽性例數(shù)，對(duì)比萋-尼氏抗酸染色法以及金胺“O”熒光染色檢查的假陽性率、假陰性率、靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度，并計(jì)算一致性系數(shù)。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示并予以χ2檢驗(yàn)，及χ2分割檢驗(yàn)（P＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）進(jìn)行兩兩比較，對(duì)兩種方法的診斷結(jié)果進(jìn)行比較（配對(duì)卡方檢驗(yàn)之三維配對(duì)卡方檢驗(yàn)），P＜0.05則視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 對(duì)比兩種染色方法檢測(cè)結(jié)果

金胺“O”熒光染色后，分枝桿菌在熒光顯微鏡下發(fā)出橘黃顏色，高倍鏡（物鏡40倍目鏡10倍）下，能夠看到分枝桿菌出現(xiàn)黃綠色熒光，呈現(xiàn)出分枝狀或者桿狀。抗酸染色后，在淡藍(lán)色背景下，抗酸菌呈紅色，其他細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色，見圖1。212例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果表明，直接涂片抗酸染色法陽性率（9.43%，20/212）低于集菌涂片抗酸染色法（13.68%，29/212），直接涂片金胺“O”熒光染色法陽性率（17.45%，37/212）低于集菌涂片金胺“O”熒光染色法（36.32%，77/212），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.62，12.37，P=0.02，0.00），見表1。集菌涂片抗酸染色法陽性率（13.68%，29/212）低于集菌涂片金胺“O”熒光染色法（36.32%，77/212），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.65，P=0.00）。2.2集菌涂片金胺“O”熒光染色、集菌涂片抗酸染色法檢查的診斷效能

金胺“O”熒光染色法的敏感度，特異性，約登指數(shù)及似然比值均優(yōu)于抗酸染色法，差異顯著（P＜0.05），即金胺“O”熒光染色較之于抗酸染色法，優(yōu)勢(shì)較大，見表1。

3.討論

對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行集菌處理被視為一個(gè)相對(duì)省時(shí)又低成本的路徑，能夠有效的強(qiáng)化痰涂片抗酸桿菌鏡檢的靈敏度[5]，本研究對(duì)沉渣涂片萋-尼染色兩種方法、直接涂片萋-尼染色、沉渣涂片萋-尼染色和沉渣涂片金銨“O”染色兩類路徑展開彼此的對(duì)比，結(jié)果顯示集菌涂片法可提高痰標(biāo)本抗酸桿菌鏡檢的陽性率；把離心集菌涂片法與金銨“O”熒光染色法有機(jī)結(jié)合，很大程度上進(jìn)一步強(qiáng)化肺結(jié)核痰涂片顯微鏡檢查手段的敏感性，同時(shí)大幅度強(qiáng)化工作者的舒適感。通過金胺“O”熒光離心集菌染色法檢測(cè)痰中的結(jié)核桿菌操作簡(jiǎn)單、靈敏度及特異新高，與抗酸染色法對(duì)比，能夠顯著提高低含菌量標(biāo)本的檢出率。