史贇學(xué)，劉文森，許娜，朱文赫，孫成彪，賈靜，沈明浩，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130000；2.中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長(zhǎng)春130000）

近年來(lái)食品安全受到世界各國(guó)的普遍關(guān)注，越來(lái)越多的組織和機(jī)構(gòu)參與實(shí)施和加強(qiáng)防治牲畜細(xì)菌性人畜共患病，致使食源性致病菌感染的數(shù)量逐年穩(wěn)步下降[1]。盡管加強(qiáng)了對(duì)食源性致病菌感染的防控措施，仍無(wú)法消除其在全球范圍的危害。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年由于食源性致病菌感染患病人數(shù)達(dá)6億，死亡約42萬(wàn)人[2]。美國(guó)每年因食源性微生物致病的人數(shù)仍有7 600萬(wàn)，死亡約5 000人；英國(guó)每年也有130余萬(wàn)人患食源性疾病[3]。食源性疾病給衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)很大的負(fù)擔(dān)，大大降低了生產(chǎn)力，給人類帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。建立有效的食源性致病菌檢測(cè)體系，快速并且準(zhǔn)確地完成對(duì)食品中致病菌的檢測(cè)已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

鼠傷寒沙門(mén)氏菌在全球范圍內(nèi)被認(rèn)為是引起食源性疾病常見(jiàn)的細(xì)菌[5]，而且鼠傷寒沙門(mén)氏菌是中國(guó)第二大食源性致病菌，每年約有40%的細(xì)菌性食物中毒事件與它有關(guān)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌易污染肉制品、海鮮、乳制品，從而導(dǎo)致疾病的爆發(fā)[6－7]。志賀氏菌是引起細(xì)菌性痢疾最常見(jiàn)的致病菌，全球每年細(xì)菌性痢疾的病例超過(guò)2億，死亡人數(shù)超過(guò)65萬(wàn)人，在中國(guó)廣大農(nóng)村地區(qū)由于醫(yī)療衛(wèi)生條件差，經(jīng)常有由于水源或者食品被志賀氏菌污染而引起的痢疾、腹瀉等疾病流行的報(bào)道[8－9]。

液相芯片是一種新型高效的檢測(cè)工具。相對(duì)于常規(guī)傳統(tǒng)檢測(cè)方法，其檢測(cè)方法更快速便捷、方便可靠，通量更高。傳統(tǒng)液相芯片檢測(cè)方法需要對(duì)微球進(jìn)行多次洗滌，微球雜交前需要提前解鏈，步驟較為繁瑣，給試驗(yàn)增加了不可控性。因此，本試驗(yàn)在引物與探針間引入間隔臂，減少了微球洗滌的步驟，節(jié)省時(shí)間，提高陽(yáng)性信號(hào)值。本研究在建立穩(wěn)定試驗(yàn)方法基礎(chǔ)上，對(duì)有無(wú)間隔臂修飾的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比，為液相芯片在食源性致病菌檢測(cè)的應(yīng)用中提供了探索依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠傷寒沙門(mén)氏菌（CMCCB50115）和福氏志賀氏菌株（CMCC51573）保藏于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全控制實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與儀器

Mgaplex－TAG磁性微球、Luminex200鞘液：美國(guó)Luminex有限公司；R－phycoerythrin conjugate：美國(guó)Invitrogen有限公司；EmeraldAmp2XPremix：大連TAKARA有限公司；Bacterial genomic DNA minor preparation kit：杭州Axygen有限公司；蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉：美國(guó)BD公司；其他所有化學(xué)試劑均為分析等級(jí)。

Luminex200液相芯片分析系統(tǒng)：美國(guó)Luminex有限公司；G－1000型梯度PCR儀：杭州博日科技有限公司；ND－1000型紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Scientific有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

從基因庫(kù)（GenBank）中查找鼠傷寒沙門(mén)氏菌與志賀氏菌的全序列，通過(guò)文獻(xiàn)和比對(duì)，選擇相應(yīng)序列的保守區(qū)間，使用Primer5.0與Oligo7.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)置間隔臂修飾組（S）與未修飾組（W），修飾組組上游引物5’端添加特異性標(biāo)簽序列TAG，TAG與引物間連接間隔臂（Spacer C3）進(jìn)行修飾，未修飾組上游引物5’端添加特異性標(biāo)簽序列Anti－TAG。兩組下游引物5’端均由生物素（biotin）進(jìn)行修飾。引物均由吉林庫(kù)美生物有限公司合成見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.2 細(xì)菌基因組DNA提取

取-80℃保藏的菌株于LB平板培養(yǎng)基上劃線，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)增培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液12 000 r/min離心1 min，使用Axygen細(xì)菌組DNA提取試劑盒分別提取細(xì)菌組DNA，-20℃保存待用。使用前用ND-1000分光光度計(jì)定量至10 ng/μL。

1.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系及條件確定

基因組DNA，PCR體系：取細(xì)菌基因組DNA0.5 μL為模板，EmeraldAmp 2 x Premix12.5 μL，上下游引物各0.5μL，ddH2o補(bǔ)足至25μL。PCR條件：94℃變性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，共 35個(gè)循環(huán)，72℃變性5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用3%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢查，對(duì)修飾組與未修飾組的擴(kuò)增情況進(jìn)行對(duì)比，確保兩組擴(kuò)增之間無(wú)明顯差距。

1.3.4 雜交體系及條件的確定

設(shè)置間隔臂修飾與未修飾兩組，每組加入PCR產(chǎn)物6 μL，加入每種Anti-TAG微球2 500個(gè)，使用移液器吹打混勻。37℃避光雜交30 min（普通組雜交前增加92℃3 min解鏈）。使用雜交緩沖液將藻紅蛋白稀釋到 10 μg/mL，每組雜交產(chǎn)物中加入 75 μL，40 ℃避光孵育30 min。

1.3.5 退火溫度的優(yōu)化

退火溫度分別選擇 52、54、56、58、60 ℃，對(duì)多重的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。雜交條件1.3.4所示，對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行Luminex上機(jī)檢測(cè)，得到熒光值強(qiáng)度中值并進(jìn)行分析，挑選最高熒光信號(hào)值所對(duì)應(yīng)的退火溫度。

1.3.6 微球雜交溫度優(yōu)化

微球雜交溫度分別設(shè)置為35、38、40、42℃，通過(guò)上機(jī)檢測(cè)熒光值強(qiáng)度中值進(jìn)行結(jié)果判定，選擇熒光信號(hào)最高組所對(duì)應(yīng)的雜交溫度。

1.3.7 微球雜交時(shí)間優(yōu)化

使用1.3.6優(yōu)化得到額雜交溫度，微球雜交時(shí)間分別取 20、25、30、35 min，通過(guò)對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，選擇熒光值強(qiáng)度中值最高的組所對(duì)應(yīng)的時(shí)間，并分析有無(wú)間隔臂對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.3.8 體系特異性

調(diào)整PCR模板進(jìn)行交叉試驗(yàn)，使用優(yōu)化后的條件。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行微球雜交與藻紅蛋白孵育，然后進(jìn)行液相芯片上機(jī)檢測(cè)，對(duì)熒光值強(qiáng)度中值進(jìn)行分析處理并對(duì)比有無(wú)間隔臂對(duì)結(jié)果的影響。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

使用所得到的最佳條件，確保在相同情況下，設(shè)計(jì)不同批次同組間的平行試驗(yàn)用以驗(yàn)證檢測(cè)體系穩(wěn)定性和重復(fù)性，共分批進(jìn)行3次試驗(yàn)，對(duì)上機(jī)檢測(cè)熒光值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算變異系數(shù)（CV%），以驗(yàn)證其穩(wěn)定性。

變異系數(shù)公式：變異系數(shù)/%=標(biāo)準(zhǔn)差/算數(shù)平均值×100

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增鑒定

按照配置的體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 PCR反應(yīng)結(jié)果Fig.1 Multiplex PCR reaction

1、2泳道131 bp處分別是C3修飾與未修飾組的鼠傷寒沙門(mén)氏菌擴(kuò)增條帶，3、4泳道72 bp處為志賀氏菌的擴(kuò)增條帶，5、6泳道為修飾與未修飾組的兩種菌的多重?cái)U(kuò)增。

2.2 退火溫度優(yōu)化

退火溫度分別設(shè)置為 52、54、56、58、60 ℃，最終上機(jī)檢測(cè)熒光值強(qiáng)度中值結(jié)果如圖2所示。

圖2 退火溫度對(duì)熒光值強(qiáng)度中值的影響Fig.2 Effect of annealing temperature on median fluorescence intensity

C3修飾組的陽(yáng)性熒光值強(qiáng)度中值均高于未修飾組2倍以上，當(dāng)退火溫度為56℃時(shí)，熒光值強(qiáng)度中值最高，故選擇56℃作為最適退火溫度。

2.3 雜交溫度的優(yōu)化

雜交溫度分別設(shè)置為35、38、40、42℃4個(gè)溫度，最終檢測(cè)熒光值結(jié)果如圖3。

圖3 微球雜交溫度對(duì)熒光值強(qiáng)度中值的影響結(jié)果Fig.3 Effect of microsphere hybridization temperature on median fluorescence intensity

修飾組的陽(yáng)性值高于未修飾組2倍以上，可以看出當(dāng)雜交溫度38℃時(shí)，得到的熒光值強(qiáng)度中值最高，因此使用38℃為最終雜交溫度。

2.4 雜交時(shí)間的優(yōu)化

使用38℃作為雜交溫度，雜交時(shí)間分別選擇20、25、30、35 min，最后機(jī)檢測(cè)熒光值強(qiáng)度中值結(jié)果如圖4所示。

圖4 雜交時(shí)間對(duì)熒光值強(qiáng)度中值的影響結(jié)果Fig.4 Effect of hybridization time on median fluorescence intensity

修飾組高于未修飾組1.5倍以上其中30、35 min是熒光值強(qiáng)度中值相近較高，考慮到試驗(yàn)整體的快速性，因此選用30 min為最終雜交時(shí)間。

2.5 特異性試驗(yàn)

3組特異性試驗(yàn)使用優(yōu)化后的各種條件，最終反應(yīng)檢測(cè)熒光信號(hào)值結(jié)果如圖5所示。

可以看出檢測(cè)體系特異性良好，并且修飾組陽(yáng)性值均高于未修飾組1.5倍以上。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖6所示不同批次試驗(yàn)之間，陽(yáng)性結(jié)果沒(méi)有明顯變化。間隔臂修飾組均于普通組2倍以上，各批次間的熒光值強(qiáng)度中值變異系數(shù)（CV）均在8%以內(nèi)，表明該體系穩(wěn)定性良好。

圖5 特異性交叉試驗(yàn)對(duì)熒光值強(qiáng)度中值的影響結(jié)果Fig.5 Effect of specific crossover experiments on the median fluorescence intensity

圖6 穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測(cè)熒光值強(qiáng)度中值影響結(jié)果Fig.6 Stability test results on the median value of fluorescence intensity

3 討論與結(jié)論

目前對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)已經(jīng)趨于成熟，如Wang等[10]使用實(shí)時(shí)PCR和數(shù)字PCR檢測(cè)乳制品中鼠傷寒沙門(mén)氏菌，并比較了兩種方法的特異性、靈敏性和檢測(cè)時(shí)間，分析了兩種方法各自的優(yōu)缺點(diǎn)。Shao等[11]使用多重環(huán)節(jié)到等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法可以同時(shí)擴(kuò)增牛奶中沙門(mén)氏菌和志賀氏菌，通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶來(lái)檢測(cè)是否有特異性擴(kuò)增，得到較好結(jié)果。但是，傳統(tǒng)多重PCR在檢測(cè)和分析結(jié)果方面有一些局限性并且有檢測(cè)通量小，效率低等問(wèn)題，需要使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒別條帶，因此對(duì)引物的設(shè)計(jì)需要考慮到區(qū)別目的條帶的大小等問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)液相芯片xTAG技術(shù)解決，xTAG技術(shù)通過(guò)使用特異性的寡核苷酸序列標(biāo)記微球，對(duì)不同的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析并且可以取得較好的結(jié)果[12]。

液相芯片是近年來(lái)興起的核酸和蛋白全面檢測(cè)的技術(shù)，和一般的病原分離鑒定，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)時(shí)間短、高通量、重復(fù)性好、靈敏度高及線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用在各類病原體檢測(cè)與研究中[13-15]。試驗(yàn)對(duì)引物進(jìn)行了間隔臂（Spacer C3）進(jìn)行修飾，不僅可以縮短檢測(cè)時(shí)間，穩(wěn)固了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針的連接，省卻了解鏈的步驟，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作并縮短了檢測(cè)時(shí)間，陽(yáng)性值較未修飾平均有1.5以上的提升，起到了良好的信號(hào)放大作用。對(duì)退火溫度、雜交溫度和時(shí)間這些條件的優(yōu)化，更加完善了檢測(cè)體系。通過(guò)混合模板進(jìn)行交叉試驗(yàn)、多批次的試驗(yàn)證明建立的液相芯片多重致病菌檢測(cè)方法，驗(yàn)證其穩(wěn)定性和特異性均良好。

該液相芯片檢測(cè)方法的建立，不僅可以對(duì)食源性致病菌的防治和傳播起到積極作用，而且為致病菌感染的預(yù)防和趨勢(shì)起到預(yù)警，間隔臂的使用在檢測(cè)領(lǐng)域，將會(huì)具有廣闊的前景。