王琳，高辰哲，崔石陽，劉冬，劉丹儀，韓建春，2，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱150030）

五味子一般指木蘭科植物五味子的成熟果實，具有抗疲勞[1]、鎮(zhèn)痛[2]、抗氧化[3]與調(diào)節(jié)腸道菌群[4]等生物功效，為中醫(yī)常用滋陰強(qiáng)腎藥，廣泛應(yīng)用于肝炎、神經(jīng)衰弱等病癥的治療[5]。五味子中含有多糖、木質(zhì)素、揮發(fā)油等生物活性成分[6]，其中多糖已經(jīng)有研究證實具有多種功效[7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、抗血脂、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)等功效，對多糖的提取和活性研究成為了新的熱點[8]。傳統(tǒng)多糖的提取方法以水提醇沉為主，但存在提取率較低的缺陷。復(fù)合酶法提取多糖因其破壞細(xì)胞壁效果好，提取條件溫和，正逐漸受到廣大研究者的重視，將復(fù)合酶法應(yīng)用于五味子多糖的提取目前研究較少。

腸道內(nèi)的菌群具有輔助營養(yǎng)吸收、生物拮抗、免疫調(diào)節(jié)等作用，可以為宿主的腸道形成一道天然屏障[9]。有研究表明，多糖可以促進(jìn)腸道中有益菌的生長，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，抑制有害菌的生長[10]。五味子多糖已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤[11]、降脂[12]、抗氧化[13]等功能，而五味子多糖能否對腸道菌群產(chǎn)生影響目前尚無明確報道。

本研究采用復(fù)合酶輔助提取五味子多糖，優(yōu)化五味子多糖的提取條件，并通過建立小鼠腸道菌群紊亂模型，對比不同劑量五味子多糖的攝入對小鼠腸道菌群的影響，初步揭示五味子多糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為其在腸道紊亂防治方面的應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子：黑龍江省北安市農(nóng)貿(mào)市場。

石油醚、苯酚、濃硫酸、氯仿：盛達(dá)生化科技有限公司；鹽酸林可霉素注射液：河南福森藥業(yè)有限公司；BBL瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、Pfizer腸球菌選擇性瓊脂、MRS瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

木瓜蛋白酶（活力50 000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；果膠酶（20 000 U/g）、纖維素酶（活力5 000 U/g）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；3種酶按質(zhì)量比1∶1∶1混合成復(fù)合蛋白酶。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP－9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、LDZX－50 KB立式壓力蒸汽滅菌器、LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；FD-1型冷凍干燥機(jī)：上海田楓實業(yè)有限公司；JD500-2型電子天平：沈陽天平儀器有限公司；TGL-16 C型高速離心機(jī)：江蘇牡丹離心機(jī)制造有限公司；SW-CJ-1 F超凈工作臺：蘇州江東精密儀器有限公司；索氏抽提器：上海比朗儀器制造有限公司；UV-2401型紫外可見分光光度計：日本島津公司；GFSJ-8高速粉碎機(jī)：安丘市經(jīng)欣粉體加工設(shè)備有限公司；HYQX-II厭氧培養(yǎng)箱：寧波賽福實驗儀器有限公司。

1.3 五味子多糖的提取

選取干燥的成熟五味子果實，使用高速粉碎機(jī)粉碎，40目篩網(wǎng)過篩得五味子干粉。使用石油醚索式抽提12 h后取出，將溶劑揮發(fā)干凈，得到預(yù)處理的脫脂樣品。各組樣品取5 g脫脂樣品，加入蒸餾水調(diào)節(jié)濃度達(dá)0.05 g/mL，在攪拌條件下，各組使用檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖溶液調(diào)節(jié)不同的pH值，注意調(diào)節(jié)過程緩慢攪拌，保證最終pH值的穩(wěn)定準(zhǔn)確。各組分別添加相應(yīng)體積的復(fù)合酶液，在一定溫度下600 r/min勻速攪拌指定時間。加入溶液體積3%的雙氧水4℃靜置脫色處理一夜，使用截留分子量為3 600 u的透析袋4℃透析48 h，透析液冷凍干燥得到五味子多糖凍干粉。以提取溫度、提取時間、提取pH值、復(fù)合酶添加量為主要因素變量，經(jīng)過單因素初篩后進(jìn)行正交試驗。

1.4 多糖含量與得率的測定

使用徐世忱等[14]的苯酚－硫酸法并做部分改動。取2 mL樣液（若檢測時吸光值超過0.9則將樣品按一定比例稀釋至2 mL）依次加入1 mL含6%苯酚的乙醇溶液、5 mL濃硫酸，常溫靜置10 min，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，在490 nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量濃度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總糖含量。

采用3，5－二硝基水楊酸比色法[15]，取2 mL樣液（若吸光值超過0.9，則按一定比例稀釋至2 mL）至25 mL具塞試管中，加入2 mL含有3，5－二硝基水楊酸的顯色劑，在沸水浴中加熱2 min后迅速冷卻，加水至刻度混勻，測定在波長540 nm下的吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算還原糖含量。

多糖含量/mg=總糖含量（mg）－還原糖含量（mg）多糖提取率/%=樣品中多糖含量（mg）/樣品質(zhì)量（mg）×100

1.5 試驗動物處理

采用同一批次、健康的昆明小鼠（KM mice，品系編碼202）120只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，5周齡～8周齡，雄性，體重18 g～22 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為5組：空白對照組、紊亂自然恢復(fù)組、多糖低劑量干預(yù)組、多糖中劑量干預(yù)組及多糖高劑量干預(yù)組。實驗開始，紊亂自然恢復(fù)組和各多糖干預(yù)組使用300 mg/mL鹽酸林可霉素灌胃，每天灌胃2次，每次0.3 mL，持續(xù)3 d，建立腸道菌群紊亂模型，空白組使用相同體積的生理鹽水灌胃[16]。小鼠在實驗期間均自由采食、取水，按照表1方案，每天定時對各組小鼠灌胃持續(xù)14 d，不同劑量的多糖使用生理鹽水預(yù)先溶解，當(dāng)天現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 小鼠處理方案Table 1 Treatment of mice

1.6 樣品的采集與處理

1.6.1 樣品采集

灌胃14 d后，頸部脫臼處死小鼠，無菌條件下，收集回盲部末端6 cm以內(nèi)的盲腸內(nèi)容物，置于干燥滅菌試管中，無菌取1 g樣品加入9 mL生理鹽水，震蕩至盲腸內(nèi)容物完全分散。

1.6.2 盲腸內(nèi)容物菌液稀釋

每份樣品分別取裝有9 mL生理鹽水的帶塞試管8支，滅菌后放置到室溫待用。取震蕩完全分散的盲腸內(nèi)容物1 mL加入到生理鹽水中，依次10倍稀釋至第8 支，稀釋度為 10－8[17]。

1.6.3 接種

如表2所示，在不同的選擇性培養(yǎng)基上涂布相應(yīng)稀釋度的樣品100 μL，每個稀釋度重復(fù)3個平行，按照表3所示培養(yǎng)條件分別進(jìn)行培養(yǎng)。

表2 細(xì)菌接種稀釋度Table 2 Bacterial dilution

表3 腸道主要菌群培養(yǎng)條件Table 3 Culture conditions of main intestinal flora

1.7 菌群培養(yǎng)與計數(shù)

使用平板活菌計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，選擇單板單菌落數(shù)在30個～300個之間的稀釋倍數(shù)計數(shù)，計算菌落總數(shù)，結(jié)果以對數(shù)形式表示[18]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

用Statistix 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3次重復(fù)獨立實驗的結(jié)果表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（means±SD），方差分析（ANOVA）使用Tukey模式，各干預(yù)組與對照組、紊亂自然恢復(fù)組的比較采用單因素方差分析法，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01為差異極顯著，采用Sigmaplot軟件進(jìn)行作圖。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 酶解輔助提取單因素試驗

設(shè)定提取溫度（30、35、40、45、50、55 ℃），提取時間（20、40、60、80、100、120 min），提取 pH 值（4、4.5、5、5.5、6、6.5），復(fù)合酶添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%）（相對于底物），4個變量中的3個保持不變，分別研究單因素指標(biāo)不同對多糖得率造成的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同因素對五味子多糖得率的影響Fig.1 Effect of different factors on the yield of polysaccharides

由圖1A可知，溫度對于多糖得率有一定影響，適當(dāng)升高溫度可以增加多糖得率，這是由于溫度升高提高多糖類物質(zhì)的布朗運動水平，使其加速擴(kuò)散到周圍溶劑中，同時適當(dāng)?shù)臏囟纫部梢栽黾用傅幕钚裕涌炝思?xì)胞壁的破壞從而促進(jìn)多糖溶出。當(dāng)溫度過高時，雖然能提高多糖的溶解效率，但酶的活力受到抑制，對多糖得率也造成了一定損失，為了保證較高的多糖得率，選擇40、45、50℃作為后續(xù)正交試驗多糖提取溫度變量。

由圖1B可知隨著提取時間的延長，多糖的得率得到提高，當(dāng)時間超過80 min時，多糖的得率不再顯著變化。這主要是因為五味子多糖隨著時間的延長逐步溶解入水中，同時，由于復(fù)合酶的作用，使五味子細(xì)胞壁受到破壞，更多的多糖類物質(zhì)逐漸溶出。而隨著時間的延長，溶劑中多糖濃度越來越高，濃度差變小減慢了多糖進(jìn)入溶劑的速度，多糖溶解入水中的速度逐漸減緩，而酶解的底物也逐漸消耗殆盡，對于多糖溶出的促進(jìn)作用越發(fā)不明顯[19]。再延長提取時間對于提取率沒有顯著的促進(jìn)作用，會造成時間和能源的浪費。綜合時間和提取率，選擇60、80、100 min作為后續(xù)正交試驗的提取時間變量。

由圖1C可知，pH值對于多糖的得率有顯著影響，當(dāng)pH值為5.5時，多糖得率達(dá)到最佳。表明此pH值條件下的復(fù)合酶活力較高，多糖溶出率也較高。隨著pH值提高或降低，酶活隨之下降，從而影響了多糖得率，這可能與多糖親水基團(tuán)及疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)系。因此，選擇5.0、5.5、6.0作為后續(xù)正交試驗的提取pH值變量。

由圖1D可知，當(dāng)復(fù)合酶用量達(dá)到提取液質(zhì)量的2.0%時，多糖得率最高達(dá)到11.8%。隨著復(fù)合酶用量的增加，相同時間內(nèi)更多的五味子細(xì)胞壁被酶解破壞，造成了多糖的溶出。而當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到一定程度時，更多的酶制劑對改善多糖得率的效果微乎其微，這可能是由于復(fù)合酶含量相對于底物過高，底物過早被消耗而造成了酶制劑的浪費[20]。為了讓酶解有效率且不過分浪費酶制劑，選擇了1.5%、2.0%、2.5%添加量作為后續(xù)正交試驗的復(fù)合酶變量。

2.2 正交試驗結(jié)果及分析

五味子多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗水平表見表4，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

由表5可知，影響酶解輔助提取五味子多糖的主次因素為：提取復(fù)合酶添加量>pH值>酶解時間>酶解溫度。K值得最適條件為A2B2C1D1，以最佳提取條件進(jìn)行驗證試驗，在最佳條件下，五味子多糖提取率為11.5%，沒有A2B2C3D1條件下獲得的五味子多糖得率高，因此試驗選用A2B2C3D1條件，即提取溫度45℃、提取時間80 min、提取pH 6.0、復(fù)合酶添加量1.5%。

表4 五味子多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗水平表Table 4 Factors and coded levels used in the orthogonal array design for optimization of polysaccharide from Schisandra chinensis extraction

表5 五味子多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design scheme and corresponding results for optimization of polysaccharide from Schisandra chinensis extraction

2.3 五味子多糖的攝入對小鼠腸道菌群的影響

2.3.1 攝入五味子多糖對雙歧桿菌的作用

經(jīng)過超濾、凍干等步驟的操作，最終能夠得到的五味子粉末多糖純度經(jīng)檢測可達(dá)到92.32%。

分別使用不同劑量的五味子多糖灌胃造模小鼠0、7、14天后，連同空白對照組和紊亂自然恢復(fù)組，研究不同劑量五味子多糖的攝入對于小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌含量的影響，如圖2所示。

由圖2可知，五味子多糖有助于提升小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的含量，持續(xù)攝入五味子多糖，小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌逐漸增多，而且隨著多糖攝入量的提高，小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的含量有所提高。雙歧桿菌具有抑制致病菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境的作用，本研究結(jié)果顯示五味子多糖能夠促進(jìn)益生菌之一——雙歧桿菌的生長，且促進(jìn)作用與多糖攝入劑量呈正相關(guān)。

圖2 各組小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量Fig.2 The quantity of Bifidodacterium on intestinal flora of mice in each group

2.3.2 攝入五味子多糖對乳桿菌的作用

分別使用不同劑量的五味子多糖灌胃造模小鼠0、7、14天后，連同空白對照組和紊亂自然恢復(fù)組，研究不同劑量五味子多糖的攝入對于小鼠腸道內(nèi)乳桿菌含量的影響，如圖3所示。

圖3 各組小鼠腸道內(nèi)乳桿菌數(shù)量Fig.3 The quantity of Lactobacilus on intestinal flora of mice in each group

由圖3可知，第7天，對比紊亂自然恢復(fù)組，中劑量組小鼠腸道內(nèi)乳桿菌的數(shù)量有極顯著增加，第14天，高劑量組小鼠腸道內(nèi)乳桿菌的數(shù)量顯著增加，持續(xù)攝入五味子多糖可以提高小鼠腸道內(nèi)乳桿菌的含量，高劑量的五味子多糖長時間飼喂能夠顯著提高小鼠腸道中的乳桿菌含量，且促進(jìn)作用與多糖攝入劑量呈正相關(guān)。

2.3.3 攝入五味子多糖對腸球菌的作用

分別使用不同劑量的五味子多糖灌胃造模小鼠0、7、14天后，連同空白對照組和紊亂自然恢復(fù)組，研究不同劑量五味子多糖的攝入對于小鼠腸道內(nèi)腸球菌含量的影響，如圖4所示。

圖4 各組小鼠腸道內(nèi)腸球菌數(shù)量Fig.4 The quantity of Enterococcus on intestinal flora of mice in each group

由圖4可知，灌胃鹽酸林可霉素后，紊亂自然恢復(fù)組小鼠腸道內(nèi)腸球菌數(shù)量極顯著升高，從第7天開始，五味子多糖中劑量組小鼠腸道內(nèi)腸球菌數(shù)量顯著降低，第14天時，低、中、高劑量組小鼠腸道內(nèi)腸球菌數(shù)量均極顯著降低，持續(xù)攝入五味子多糖可以顯著降低小鼠腸道內(nèi)腸球菌的含量，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.3.4 攝入五味子多糖對大腸桿菌的作用

分別使用不同劑量的五味子多糖灌胃造模小鼠0、7、14天后，連同空白對照組和紊亂自然恢復(fù)組，研究不同劑量五味子多糖的攝入對于小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌含量的影響，如圖5所示。

由圖5可知，灌胃鹽酸林可霉素后，小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量顯著升高，喂食五味子多糖后小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量呈下降趨勢，在第14天時，中、高劑量五味子多糖組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量分別顯著、極顯著降低，持續(xù)攝入五味子多糖可以顯著降低小鼠腸道內(nèi)腸球菌的含量，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 五味子多糖對小鼠體重的影響

實驗期間各組小鼠體重變化見圖6。

圖5 各組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量Fig.5 The quantity of Escherichia on intestinal flora of mice in each group

圖6 實驗期間各組小鼠體重變化Fig.6 The body weight of mice in each group during the experiment

由圖6可見，小鼠喂食期間體重的變化可見，同空白組比較，紊亂自然恢復(fù)組小鼠體重極顯著降低，不同劑量五味子多糖對小鼠體重的影響有差異，其中高劑量組小鼠體重變化與空白組相似，可見，不同劑量五味子多糖在發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群作用的同時對小鼠機(jī)體的生長有一定的影響

3 結(jié)論與討論

健康的人體內(nèi)存在大量微生物，長期與機(jī)體保持平衡。腸道內(nèi)菌群形成微生態(tài)系統(tǒng)，以保護(hù)機(jī)體免受各種疾病的損傷。當(dāng)人體腸道的菌群紊亂時，益生菌會大量減少，有害菌會大量增殖，破壞腸道環(huán)境。腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌共同保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)節(jié)的干擾，適當(dāng)提高腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量可以更好的為機(jī)體設(shè)立防御系統(tǒng)。

通過單因素和正交試驗可知，酶解輔助提取五味子多糖的最佳條件為提取溫度45℃、提取時間80 min、提取pH 6.0、復(fù)合酶添加量1.5%，復(fù)合酶添加量對酶法提取五味子多糖影響最大，多糖提取率達(dá)到11.59%，五味子粉末多糖純度經(jīng)檢測可達(dá)到92.32%。

與空白對照組比較，紊亂自然恢復(fù)組內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量均顯著減低，腸球菌、大腸桿菌數(shù)量極顯著增加，表明成功建立了腸道菌群失調(diào)小鼠模型，破壞了小鼠腸道內(nèi)菌群形成的微生態(tài)系統(tǒng)。在此條件下攝入五味子多糖，腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌數(shù)量顯著增高，腸球菌、大腸桿菌等條件性致病菌的數(shù)量顯著降低，且均存在劑量效應(yīng)關(guān)系，同時對小鼠機(jī)體的生長有一定的影響。表明五味子多糖確實能夠在一定程度上調(diào)節(jié)因鹽酸林可霉素導(dǎo)致的腸道紊亂，且高劑量的多糖對以上指標(biāo)的改善效果最好。這可能是由于腸道內(nèi)有益菌利用多糖進(jìn)行代謝后產(chǎn)生了乳酸、乙酸等短鏈脂肪酸，降低了腸道內(nèi)的pH值，從而抑制腸球菌、大腸桿菌的生長。