周偏，梁叢穎，烏日娜，蔡坤，劉四新，李從發(fā)，*

（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.海南大學材料與化工學院，海南海口570228）

諾麗（Noni，Morinda citrifolia Linn），又稱海巴戟、海巴戟天，屬茜草科海巴戟天屬藥用植物，主要分布在南太平洋諸島嶼、澳大利亞、東南亞，以及我國的部分海域[1]。在波利尼西亞，諾麗作為傳統(tǒng)的保健食品和藥品已有2 000多年的歷史[2]。諾麗含有豐富的生物活性成分，包括多糖、生物堿、環(huán)烯醚萜、蒽醌、東莨菪素、糖苷類化合物、維生素和礦物質等[3-5]?，F代研究顯示諾麗具有抗血栓、降血糖、抗菌活性，以及清除自由基，調節(jié)膽固醇，刺激免疫系統(tǒng)，調節(jié)細胞功能和凈化血液等多種功能，對癌癥、糖尿病、高血壓和痛風等多種疾病有較好的預防和治療作用[6-8]。1943年，美國將諾麗認定為可食用植物資源；2002年，歐盟認定諾麗果汁為一種新資源食品；2010年，中國衛(wèi)生部批準諾麗果漿為新資源食品。目前投放市場的諾麗產品種類繁多，主要有諾麗發(fā)酵汁（諾麗酵素）、鮮榨汁、果粉以及果茶等，其中以諾麗發(fā)酵汁最為暢銷，保健功效性也宣稱最佳。當前國內外諸多諾麗加工企業(yè)對諾麗發(fā)酵汁的生產工藝以傳統(tǒng)自然發(fā)酵為主，將果裝入密封罐或桶中避光自然發(fā)酵（時間為二個月至一年不等），隨著發(fā)酵的進行，果汁從果肉中自然滲出，滲出的發(fā)酵汁顏色由淺褐色漸漸變深，最終呈深褐色，過濾后即得諾麗發(fā)酵汁[9]。由于諾麗發(fā)酵汁在生產過程中缺乏官方標準的質量控制程序和評價體系，所以通常區(qū)分高質量和低質量的諾麗發(fā)酵汁是困難的[10]。2007年，Potterat等[11]報道了可用于諾麗產品質量控制的定量高效液相色譜-質譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS） 分析方法，確定了東莨菪素、環(huán)烯醚萜、蒽醌和3-甲基-1，3-丁二醇作為諾麗發(fā)酵汁的典型標記特征化合物。2011年，Basar和 Westendorf[12]確定了基于測定 2E，4Z，7Z-癸三烯酸（2E，4Z，7Z-decatrienoic acid，DTA），東莨菪素和鉀3種標記化合物的諾麗發(fā)酵汁質量評價的方法，使用此方法，可以簡單區(qū)分諾麗果汁有或沒有發(fā)酵步驟。

目前市場上諾麗發(fā)酵汁產地、品牌繁多，不同產地諾麗發(fā)酵汁的風味、顏色深淺各不相同。對其主要成分和活性物質的測定僅僅局限于單個地區(qū)，地區(qū)間的營養(yǎng)和活性成分的比較還鮮有報道。隨著諾麗發(fā)酵汁較高的營養(yǎng)、藥用和經濟價值逐漸被人們認識，需求量將逐漸增大。為此，本研究通過測定國內外6個不同產地諾麗發(fā)酵汁的主要營養(yǎng)成分和活性物質含量，并通過主成分分析對其進行評價，尋找諾麗發(fā)酵汁產地間的營養(yǎng)活性成分差別，了解不同地區(qū)、種植環(huán)境和生產技術等因素對諾麗發(fā)酵汁品質的影響，以期為諾麗發(fā)酵汁的質量分析、品質評價及其產品合理選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾麗發(fā)酵汁均為商業(yè)市售，分別選自斐濟、新西蘭、泰國、大溪地、海南?？诤秃Ｄ先f寧6個原產地，樣品編號分別為：FJ、NZ、TL、DXD、HNH、HNW。

牛血清白蛋白標準品（純度＞98%）、考馬斯亮藍、福林酚：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸標準品（純度＞98%）、蘆丁標準品（純度＞98%）、東莨菪素標準品（純度＞98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）：美國 Sigma公司；去乙酰車業(yè)草苷酸標準品：武漢天植生物技術有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PB303-N電子精密天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；TG16-WS高速離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；3B-5200-DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 營養(yǎng)成分的測定

總酸含量測定：參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，以乙酸計量；蛋白質含量測定：采用考馬斯亮藍方法[13]測定，通過牛血清白蛋白標準曲線回歸方程（y=0.020 7x+0.054 2，相關系數 R2=0.998 3）計算；還原糖含量測定：采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色法[14]測定，通過葡萄糖標準曲線回歸方程（y=0.993 2x-0.008 7，相關系數R2=0.999 7）計算；總酚含量的測定：采用福林酚（Folin-Ciocalteu，FC）比色法[15]測定，通過沒食子酸標準曲線回歸方程（y=0.103 7x+0.015 2，相關系數 R2=0.998 9）計算；總黃酮含量的測定：采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[16]測定，通過蘆丁標準曲線回歸方程（y=0.007 1x-0.025 5，相關系數為R2=0.998 6）計算。

1.3.2 體外抗氧化活性的測定

DPPH·清除能力測定：參考MISHRA K等[17]的方法測定，以DPPH·清除率表示；ABTS+·清除能力測定：參考RE R等[18]的方法測定，以ABTS+·清除率表示；·OH清除能力測定：參考張偉敏等[19]的方法測定，以·OH自由基清除率表示；總還原力能力測定：參考OYAIZU M等[20]的方法測定，以吸光值表示。自由基清除率公式：

式中：Ai為待測夜在測定波長時的樣品吸光值；Aj為測定液在測定波長時的空白吸光值；Ac為未加測定液時模型的吸光值。

1.3.3 有機酸含量的測定

參照Sabokbar等[21]的方法稍作改進，采用液相色譜儀測定諾麗發(fā)酵汁中的有機酸含量。色譜條件：液相色譜儀：安捷倫1260，配有紫外檢測儀；色譜柱：安捷倫 Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀（pH=2.5）∶甲醇=98∶2（體積比）；柱溫 30 ℃；流速 0.5 mL/min；進樣量 10 μL；波長210 nm；等度洗脫40 min。

1.3.4 活性物質的測定

東莨菪素測定：參照謝婷[22]的方法稍加改進，采用安捷倫1260液相色譜儀進行測定。色譜條件：色譜柱：Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 ∶乙酸水溶液（0.1%）=30∶70（體積比）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；紫外檢測波長：346 nm；等度洗脫20 min。

去乙酰車葉草苷酸測定：參照陳建國等[23]的方法稍加改進，采用安捷倫1260液相色譜儀進行測定。色譜條件：色譜柱：Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A：0.1%磷酸水溶液，B：乙腈；梯度洗脫：0～10 min 4%B；10 min～22 min 15%B；22 min～40 min 4%B。流速：0.5 mL/min；柱溫：35℃；紫外檢測波長：237nm；進樣量：10 μL；梯度洗脫 40 min。

1.3.5 統(tǒng)計分析

試驗數據均是3次重復試驗的平均值，結果表示為平均值±標準偏差（Mean±SD）。應用SPSS 24.0軟件進行Duncan’s組間差異顯著性統(tǒng)計和主成分分析（P＜0.05）。主成分分析（principal component analysis，PCA）時，以6個樣品中19個指標因子的定量結果組成6行19列矩陣，數據經標準化處理后進行分析，以累計貢獻率達95%以上來確定主成分的個數，同時將提取的主成分根據公式∑λiui（λ：主成分貢獻率，u：各樣品主成分值，i：1～4）計算各樣品的綜合得分。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同產地諾麗發(fā)酵汁營養(yǎng)成分分析

不同產地諾麗發(fā)酵汁的營養(yǎng)成分測定結果見表1。

表1 不同產地諾麗發(fā)酵汁營養(yǎng)成分含量Table 1 The contents of the nutritional ingredients in fermented noni juice from different regions

由表1可知，不同產地諾麗發(fā)酵汁中各項營養(yǎng)成分指標具有明顯的差異。不同產地諾麗發(fā)酵汁的總酸含量介于7.176g/L～13.728g/L之間，TL諾麗發(fā)酵汁的總酸含量（13.728 g/L）顯著高于其他產地（P＜0.05），最低為海南?？诋a地（HNH），其總酸含量為7.167g/L，總酸含量高于10 g/L的產地僅有TL和?？谌f寧產地（HNW）；不同產地諾麗發(fā)酵汁的蛋白質含量普遍較低，介于0.063mg/mL～0.230 mg/mL之間，斐濟產地（FJ）的蛋白質含量最高為0.230mg/mL，與新西蘭產地（NZ）和HNH沒有統(tǒng)計學上差異（P＞0.05），TL 的蛋白質含量最低，為 0.063 mg/mL；不同產地諾麗發(fā)酵汁中還原糖含量較為豐富，其含量在34.935mg/mL～89.979mg/mL之間，其中NZ的還原糖含量（89.979mg/mL）顯著高于其他產地（P＜0.05），是HNW發(fā)酵汁含量（34.935 mg/mL）的2.5倍之多；不同產地諾麗發(fā)酵汁中總酚和總黃酮含量差異顯著（P＜0.05），總酚含量介于0.790 mg/mL～1.262 mg/mL之間，總黃酮含量在0.377 mg/mL～0.833 mg/mL之間。其中NZ發(fā)酵汁的總酚和總黃酮含量最高，分別為1.262 mg/mL和0.833 mg/mL，顯著高于其他產地（P＜0.05），總酚含量最低為HNH發(fā)酵汁（0.790 mg/mL），總黃酮含量最低的為TL發(fā)酵汁（0.377 mg/mL）。李曉花等[24]對泰國、海南和西雙版納3個產地諾麗干果的主要營養(yǎng)成分、礦物質和氨基酸的含量進行了分析和比較，發(fā)現不同產地中營養(yǎng)成分含量差別較大，且不具規(guī)律性，從營養(yǎng)成分角度考慮，海南和西雙版納均適宜諾麗的種植。程池等[16]比較了我國西沙與大溪地產地的諾麗發(fā)酵汁總黃酮含量，發(fā)現西沙諾麗果汁中總黃酮含量范圍為0.250 mg/mL～0.301 mg/mL，平均含量為 0.274 mg/mL，與大溪地諾麗果汁無明顯差異（平均含量為0.223mg/mL）。說明可能由于不同產地土壤、氣候等生長條件有所差異，導致諾麗發(fā)酵汁營養(yǎng)成分差異性較大。

2.2 不同產地諾麗發(fā)酵汁抗氧化活性分析

不同的抗氧化化合物可能通過不同的作用機制與氧化劑發(fā)生反應，一個孤立的方法很難全面評估抗氧化劑的抗氧化能力，通常采用多種評價體系來衡量抗氧化特征[25－26]。因此，通過測定清除 DPPH·、ABTS+·、·OH能力和總還原力4種抗氧化活性體系來評價不同產地諾麗發(fā)酵汁的抗氧化能力，結果如表2所示。

表2 不同產地諾麗發(fā)酵汁的抗氧化活性Table 2 The antioxidant activity of fermented noni juice from different regions

由表2可知，不同產地諾麗發(fā)酵汁均顯示出不同程度的自由基清除能力和還原能力。不同產地諾麗發(fā)酵汁對不同自由基的清除能力和還原力上顯著差異（P＜0.05）。NZ和FJ在清除DPPH·能力上最強，清除率分別為67.536%、65.842%。而TL的DPPH·清除率最低（38.362%）。類似的，NZ在清除ABTS+·能力上依然保持較好的抗氧化性能，清除率高達77.594%，顯著高于其他產地樣品（P＜0.05）。各產地諾麗發(fā)酵汁對·OH清除能力與DPPH·清除能力相一致，清除率由大到小依次為：NZ（DPPH·：67.536%，·OH：51.534%）＞ FJ（DPPH·：65.854%，·OH：47.516%）＞DXD（DPPH·：57.894%，·OH：46.363%）＞ HNW（DPPH·：46.355%，·OH：44.642%）＞HNH （DPPH·：44.528%，·OH：40.989%）＞TL（DPPH·：38.362%，·OH：35.662%）?？傔€原能力的強弱以吸光度值的大小衡量，吸光度值越大表示還原能力越強。FJ和NZ產地的諾麗發(fā)酵汁總還原能力較強，吸光值為0.470和0.462，其次為HNH（0.376）和 DXD（0.356），HNW 和 TL 還原能力相對較弱（HNW：0.266，TL：0.254）。結果表明，諾麗發(fā)酵汁對各自由基具有較強的清除能力以及良好的還原能力。不同產地的諾麗發(fā)酵汁其抗氧化活性存在一定程度的差異。新西蘭（TL）和斐濟（FJ）的兩種產地諾麗發(fā)酵汁表現最好。

2.3 不同產地諾麗發(fā)酵汁有機酸含量分析

有機酸是發(fā)酵汁中主要的風味營養(yǎng)物質，其含量高低與發(fā)酵汁制品的品質有密切的關系。此外，發(fā)酵汁中的有機酸還可促進消化腺的活動，有助于食物的吸收，具有開胃和促進消化的作用[27]。通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對不同產地諾麗發(fā)酵汁的8種有機酸含量測定，結果見表3。

由表3可知，8種有機酸在所有產地諾麗發(fā)酵汁樣品中均有檢出。各產地諾麗發(fā)酵汁中的有機酸含量存在一定的差異和相似性，各樣品有機酸總含量在22.238 mg/mL～35.286 mg/mL之間，其中TL發(fā)酵汁有機酸含量最高達到35.286 mg/mL，其次為NZ（27.660 mg/mL），HNH和HNW發(fā)酵汁有機酸總量相近，分別為30.357、29.664 mg/mL，FJ和DXD發(fā)酵汁含量較低，分別為23.058、22.238 mg/mL。在所有樣品中，8種有機酸在各產地的諾麗發(fā)酵汁中組成含量相似，均以半乳糖醛酸含量最高，其次為蘋果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸，酒石酸和檸檬酸含量較低，而延胡索酸含量微乎其微。TL發(fā)酵汁半乳糖醛酸含量最高，占其有機酸酸總量的75.874%，其次為乙酸（6.029 mg/mL），占總量的17.286%；NZ發(fā)酵汁中半乳糖醛酸含量為13.473 mg/mL，占總量的48.709%，蘋果酸、乳酸和琥珀酸含量次之，分別占總量的18.232%、15.651%和12.343%。FJ發(fā)酵汁中半乳糖醛酸、蘋果酸和琥珀酸含量較高，分別占總量的45.693%、25.098%和18.150%。HNH和HNW中有機酸組成含量相似，半乳糖醛酸、乳酸和琥珀酸含量較高。DXD發(fā)酵汁中半乳糖醛酸、琥珀酸和乙酸較高，分別占總量的76.266%、12.303%和6.813%，乳酸含量相比其他產地含量較低。

表3 不同產地諾麗發(fā)酵汁有機酸含量Table 3 The contents of organic acid in fermented noni juice from different regions mg/mL

續(xù)表3 不同產地諾麗發(fā)酵汁有機酸含量Continue table 3 The contents of organic acid in fermented noni juice from different regions mg/mL

2.4 不同產地諾麗發(fā)酵汁活性物質分析

諾麗中富含多種生物活性化合物，東莨菪素和去乙酰車業(yè)草苷酸是諾麗中兩種主要的活性物質，具有抗腫瘤、抗氧化、抗畸變和降血脂等功能[28－29]。通過HPLC對不同產地諾麗發(fā)酵汁中兩種活性物質含量進行了測定，測定結果見圖1。

圖1 不同產地諾麗發(fā)酵汁中活性物質含量Fig.1 The contents of active substances in fermented noni juice from different regions

由圖1可知，各樣品中去乙酰車業(yè)草苷酸含量高于東莨菪素，不同產地發(fā)酵汁中東莨菪素和去乙酰車業(yè)草苷酸含量差異顯著（P＜0.05）。NZ發(fā)酵汁中東莨菪素含量最高，達到76.873 μg/mL，顯著高于其他產地（P＜0.05），其次為 FJ（56.468 μg/mL）、HNH（28.451 μg/mL）、HNW（27.239 μg/mL）和 TL（13.097 μg/mL），DXD 含量最低（11.203 μg/mL）；FJ發(fā)酵汁中去乙酰車業(yè)草苷酸含量最高，達到1.235 mg/mL，顯著高于其他產地（P＜0.05），其次為 NZ（1.167 mg/mL），HNH（0.785 mg/mL）、HNW（0.592 mg/mL）和 DXD（0.325 mg/mL），TL 含量最低（0.121 mg/mL）?？傮w上，在兩種活性成分方面，NZ和FJ產地均優(yōu)于其他4種產地，其次為HNH和HNW，而DXD和TL差之。Potterat等[11]采用薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）標記鑒定及 HPLCMS定量分析比較不同產地8種商業(yè)諾麗發(fā)酵汁中東莨菪素和去乙酰車業(yè)草苷酸含量，發(fā)現東莨菪素含量在未檢出到0.023 mg/mL之間，去乙酰車業(yè)草苷酸在0.23 mg/mL～2.42 mg/mL之間，其斐濟產地兩者含量均高于大溪地和泰國產地，這與我們結論相一致。

2.5 不同產地諾麗發(fā)酵汁各指標的主成分分析

諾麗發(fā)酵汁品質的構成因子較多，不同品質因子之間存在著密切相關性和相對獨立性。為綜合評價不同產地諾麗發(fā)酵汁的營養(yǎng)成分和活性物質差異，對已測定的營養(yǎng)成分、抗氧化活性、有機酸和活性物質共19個因子在構建6行×19列矩陣的基礎上進行主成分分析（principal component analysis，PCA），將各指標因子進行無量綱標準化處理后，求得的相關系數矩陣，根據累計方差貢獻率大于95%的原則提取了4個主成分。其中不同產地諾麗發(fā)酵汁的主成分1與主成分2因子載荷圖如圖2所示。由圖2可知，第一主成分的貢獻率為39.116%，而第二主成分的貢獻率為23.285%，兩者總和貢獻率為62.401%，表明前兩主成分并未能完全體現諾麗發(fā)酵汁中全部信息，而提取的前四個主成分的詳細載荷矩陣如表4所示。

圖2 不同產地諾麗發(fā)酵汁的主成分1（PC1）與主成分2（PC2）因子載荷圖Fig.2 Graphical representation of the principal component analysis of fermented noni juice from different regions showing PC1 vs PC2：factor loading

表4 主成分因子載荷矩陣Table 4 Component load matrix after principal component analysis

由表4可知，前4個主成分的特征值分別為7.432、4.424、3.775和3.062，累積方差貢獻率達98.386%，說明前4個主成分基本能夠客觀反映諾麗發(fā)酵汁各指標信息。決定第1主成分（PC1）大小的主要是總酸、蛋白質和乙酸；決定第2主成分（PC2）大小的主要是總酚、·OH和DPPH自由基清除率；決定第3主成分（PC3）大小的主要是去乙酰車業(yè)草苷酸、東莨菪素和蘋果酸；決定第4主成分（PC4）大小的主要是乳酸和還原糖。

2.6 不同產地諾麗發(fā)酵汁品質綜合評價

通過累計方差貢獻率提取的4個主成分為綜合評價的指標，計算得到不同產地諾麗發(fā)酵汁的主成分得分及綜合得分見表5。

表5 不同產地諾麗發(fā)酵汁的主成分得分及綜合排序Table 5 Factor scores and comprehensive ranking of fermented noni juice from different regions

由表5可知，FJ和NZ諾麗發(fā)酵汁分別排第一和第二，其次為HNH、DXD和HNW，TL綜合得分最低。

在目前諾麗發(fā)酵汁營養(yǎng)成分和活性物質的評價方法和指標體系尚沒有確定的背景下，借鑒其他食品種類[30-32]的數學分析方法，主成分分析為評價諾麗發(fā)酵汁營養(yǎng)質量指標提供一定的技術分析支撐，以期對只依據部分活性物質來評價諾麗發(fā)酵汁品質的方法提供了一條新的思路。

3 結論

本研究對國內外6個不同產地的諾麗發(fā)酵汁的營養(yǎng)成分和活性物質進行分析與評價。結果表明，諾麗發(fā)酵汁的營養(yǎng)成分、抗氧化活性、有機酸和活性物質等指標均呈現明顯的產地差異性。在營養(yǎng)成分方面，TL總酸含量顯著高于與其他產地。NZ還原糖、總酚和總黃酮含量均高于其他產地。在抗氧化活性方面，NZ的自由基清除能力均優(yōu)于其他產地，FJ在還原能力上表現最好。6個產地的諾麗發(fā)酵汁均檢出8種有機酸且各有機酸含量差異明顯。各產地諾麗發(fā)酵汁有機酸組成中均以半乳糖醛酸含量最高，延胡索酸含量最低，在總量上，以TL為最高，這與總酸含量相吻合。在活性物質方面，NZ和FJ的東莨菪素和去乙酰車業(yè)草苷酸含量均高于其他4種產地。通過主成分分析發(fā)現，FJ綜合品質評價評分最高，其次為NZ，表明其綜合營養(yǎng)品質較為優(yōu)良，而TL得分較低。