豆榮，戎瑜，李曉樂，聞禹鑫，周偏，蔡坤

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70100）

諾麗（Noni）又名海巴戟，屬茜草科巴戟屬植物。果 實為橢圓形、長可達(dá)15 cm，有腐臭的奶酪味，四季有果[1-2]。研究顯示，諾麗果富含多糖，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多種生物活性[3-5]。

植物多糖的提取通常采用酸或堿等化學(xué)溶劑提取法，超聲波和微波等物理輔助提取法，單一或復(fù)合酶解等提取方法[6]。其中，水提醇沉法是多糖提取的經(jīng)典方法，近年來超聲波輔助水提應(yīng)用到此方法中，用以提高多糖的提取含量[7]。因為水的極性較高，此方法提取后含有蛋白質(zhì)、色素及極性小分子等物質(zhì)。大孔吸附樹脂具有選擇性吸附特性，對多糖有良好的除雜效果[8－9]。目前，關(guān)于大孔樹脂純化諾麗多糖的研究還未見報道。

本試驗對比了熱水浸提法和超聲波輔助水提法提取諾麗鮮果多糖的提取含量；根據(jù)Box－Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，分析D301－R型大孔樹脂料液比、pH值和溫度3個因素對諾麗多糖保留率、蛋白去除率和脫色率綜合指標(biāo)的影響[10]，初步對諾麗鮮果多糖純化進(jìn)行了工藝優(yōu)化。旨為諾麗產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

諾麗：海南萬寧諾麗產(chǎn)業(yè)基地；弱堿性陰離子大孔交換樹脂（D301－R）：南開大學(xué)化學(xué)廠；重蒸酚（分析純）：Solarbio公司；牛血清蛋白：美國Gibco公司；考馬斯亮藍(lán)G250：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、丙三醇、濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉和無水乙醇等其他常規(guī)試劑（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R502B型）：上海申生儀器有限公司；離心機(jī)（D－78532型）：Hettich公司；pH計（400型）：安萊立思儀器科技（上海）有限公司；紫外分光光度計（TU－1810）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 粗多糖提取

熱水浸提法與超聲波輔助水提法對比。成熟的諾麗果打漿。水提條件[11]為：10 ∶1（mL/g），80 ℃，2 h，200目紗布過濾，濾渣復(fù)提一次；超聲波輔助水提[12]條件為：10∶1（mL/g），70 ℃，300 W，45 min，200 目紗布過濾，濾渣復(fù)提一次。合并兩次上清液，旋蒸濃縮10倍。離心（8 000×g，25℃，10 min）取上清液，即得諾麗鮮果粗多糖溶液。

1.2.2 大孔樹脂預(yù)處理

將大孔樹脂（D301－R）放置于飽和氯化鈉溶液中浸泡過夜；用蒸餾水清洗后放置于2%～5%的HCl溶液浸泡4 h，水洗至中性；放置于2%～5%的NaOH溶液中浸泡4 h，水洗至中性；重復(fù)以上酸－水－堿－水淋洗步驟3遍～5遍，最后用蒸餾水洗凈后浸泡備用。使用時瀝干即可。

1.2.3 分析方法

多糖含量的測定：總糖采用苯酚硫酸法[13]，還原糖采用3，5二硝基水楊酸法[14]。多糖保留率的計算公式：

式中：M前和N前為大孔樹脂吸附前總糖和還原糖含量；M后和N后為大孔樹脂吸附后總糖和還原糖含量。

蛋白質(zhì)含量的測定：采用考馬斯亮藍(lán)法[15]。蛋白質(zhì)去除率的計算公式如下：

式中：H前和H后分別為大孔樹脂吸附前和吸附后的蛋白質(zhì)含量。

色素的測定：直接取粗多糖溶液在波長420 nm處測定OD值[16]。脫色率計算公式如下：

式中：OD前和OD后分別為大孔樹脂吸附前和吸附后溶液的光密度值。

諾麗粗多糖經(jīng)大孔樹脂吸附后，對多糖保留率、蛋白去除率、脫色率3項指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和，其權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.3和0.3[9]。依據(jù)公式：

式中：U為加權(quán)值；X為多糖保留率，%；Y為蛋白去除率，%；Z為脫色率，%。

1.2.4 單因素試驗設(shè)計

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取3個顯著性影響因素：料液比、pH值和溫度，利用Design－Expert 8.0.5數(shù)據(jù)處理軟件，采用中心組合試驗Box－Behnken設(shè)計試驗方案，設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，設(shè)計因素、水平及編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平Table 1 Level and code of independent variable used for response surface analysis

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，響應(yīng)面試驗采用Design－Expert 8.0.5軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對諾麗粗多糖提取量的影響

不同提取方法對諾麗粗多糖提取量的影響見圖1。

圖1 熱水浸提與超聲波輔助水提諾麗鮮果多糖的比較Fig.1 Contrasts hot water extraction with ultrasonic assisted water extraction polysaccharides in Noni fruit

由圖1可知，熱水浸提法提取諾麗鮮果多糖后，測得粗多糖含量為（7.21±0.53）mg/g；超聲波輔助水提法提取諾麗鮮果多糖后，測得粗多糖含量為（14.72±1.48）mg/g?？梢姵暡ㄝo助水提能顯著提高諾麗鮮果粗多糖的提取含量（P＜0.05），采用此方法提取后續(xù)實驗的粗多糖。

2.2 諾麗鮮果粗多糖除雜的單因素試驗

2.2.1 料液比對樹脂吸附效果影響

諾麗鮮果粗多糖的料液比對樹脂吸附效果影響見圖2。

Path Planning of Unmanned Surface Vehicle Based on Variable Mesh Improved Genetic Algorithm

圖2 料液比對樹脂脫色除蛋白的影響Fig.2 The effect of D301-R on protein and color

如圖2所示，隨著料液比的增大，脫色率和蛋白去除率呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，在樹脂添加量為0.2 g/mL以上，脫色率和蛋白去除率增大變得緩慢（P＞0.05）。多糖保留率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，樹脂添加量為0.1 g/mL以上，呈現(xiàn)快速下降趨勢。結(jié)果表明，大孔樹脂的添加量越多，對三者的吸附量越大。綜合考慮，初步確定大孔樹脂添加量為0.15 g/mL。

2.2.2 pH值對樹脂吸附效果影響

諾麗鮮果粗多糖的pH值對樹脂吸附效果影響見圖3。

圖3 pH值對樹脂脫色除蛋白的影響Fig.3 The effect of pH on protein and color

由圖3可以看出，在pH 3～8范圍內(nèi)，脫色率和蛋白去除率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。其中在pH值由4～6時下降較為劇烈（P＜0.05）。多糖保留率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH=5時達(dá)到最大值（91.68±3.68）%。這可能是因為溶液在過酸或者堿性的條件下會對多糖的結(jié)構(gòu)造成破壞[17]。綜合考慮3個指標(biāo)初步選擇pH=5.0。

2.2.3 溫度對樹脂吸附效果影響

諾麗鮮果粗多糖的溫度對樹脂吸附效果影響見圖4。

圖4 溫度對樹脂脫色除蛋白的影響Fig.4 The effect of temperature on protein and color

如圖4所示，隨著溫度的升高，多糖保留率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在溫度為50℃時多糖保留率最高（91.98±2.45）%。可見溫度較低不利于多糖的提取，溫度過高可能引起多糖的降解[18]。蛋白去除率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。色素去除率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，和多糖變化趨勢一致，在50℃時達(dá)到最大值（38.78±3.16）%。綜合考慮3個指標(biāo)，初步確定溫度為50℃。

2.2.4 時間對樹脂吸附效果影響

諾麗鮮果粗多糖處理所用的時間對樹脂吸附效果影響見圖5。

圖5 時間對樹脂脫色除蛋白的影響Fig.5 The effect of time on protein and color

如圖5所示，隨著時間的延長，多糖保留率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，脫色和蛋白去除率呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，時間在2小時后，大孔樹脂的吸附能力趨向平穩(wěn)。綜合考慮3個指標(biāo)，初步確定時間為2 h。

2.3 諾麗鮮果粗多糖除雜的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 Box-Benhnken中心組合試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以樹脂用量、pH值和溫度3個因素為自變量，以諾麗鮮果多糖保留率、蛋白去除率和脫色率的加權(quán)值為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行三因素三水平的試驗設(shè)計，共包括17組試驗方案，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert 8.05軟件對表2的U（加權(quán)值）進(jìn)行多元回歸擬合，得到U為響應(yīng)值的回歸模型為：

為了檢驗諾麗鮮果多糖脫色除蛋白工藝的回歸模型的有效性，對上述回歸模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果如表3所示。

表3 樹脂除雜效果加權(quán)值回歸方程方差分析表Table 3 ANOVA for U with different extraction conditions

如表3中方差分析可知，這個模型的P<0.001（極顯著），失擬項P>0.05（不顯著），表明方程擬合性好，試驗誤差小。模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.997 1，表明模型的線性較好。模型的R2Adj=0.993 4，表明該模型擬合度較好，0.39%的變異系數(shù)（C.V.）表明該模型重現(xiàn)性好。因此可以利用該模型確定最佳工藝條件。從該模型方差分析結(jié)果還可看出，對D301-R大孔樹脂多糖保留、除蛋白和除色素的綜合效果影響極顯著的有一次項A、B，交互項AC、BC，二次項A2、B2、C2（P<0.001）；無顯著影響的是一次項C和二次項AB（P>0.05）。表明各影響因素對多糖保留率的影響不是簡單的線性關(guān)系。通過方程回歸系數(shù)及其顯著性可知對諾麗鮮果多糖除雜影響因素主次順序依次為樹脂用量>pH值>溫度。剔除影響不顯著的各項，簡化后的回歸方程為：

2.3.2 兩因素間的交互效應(yīng)分析

利用Design-Expert 8.0.5軟件，以加權(quán)值綜合效果為響應(yīng)值，對料液比、pH值和溫度3個因素進(jìn)行兩兩交互作用分析，所得到的等高線圖和3－D曲線圖如圖6～圖8所示。

圖6 料液比和pH值交互影響樹脂除雜效果圖Fig.6 RSM analysis for impurity removal of the resin dosage and pH

圖7 料液比和溫度交互影響樹脂除雜效果圖Fig.7 RSM analysis for impurity removal of the resin dosage and temperature

圖8 pH值和溫度交互影響樹脂除雜效果圖Fig.8 RSM analysis for impurity removal of temperature and pH

如圖6～圖8所示，3－D圖中圖型的陡峭程度越大，表明兩因素交互作用越顯著，等高線中圖形越接近圓形，表明兩因素交互作用越不顯著[19]。通過對3－D圖的陡峭程度分析，料液比對樹脂除雜保多糖的影響最大，其次是pH值和溫度。通過對等高線分析，發(fā)現(xiàn)pH值和溫度的等高線為橢圓形，說明這兩個因素交互作用顯著。而料液比和pH值的等高線呈圓形，說明這兩個因素交互作用不顯著。這與方差結(jié)果一致。

2.3.3 大孔樹脂純化諾麗粗多糖的最佳工藝條件

通過Design－Expert 8.0.5軟件分析，以加權(quán)值為響應(yīng)值，確定D 301－R大孔樹脂初步純化諾麗粗多糖的最佳工藝條件為：料液比0.17 g/mL、pH=4.91、溫度49.30℃，此條件下加權(quán)值為64.14%?？紤]實際操作情況，確定大孔樹脂初步對諾麗多糖除雜的最佳工藝條件為：料液比0.17 g/mL，pH=5.00，溫度49℃。對此優(yōu)化條件進(jìn)行驗證，驗證試驗結(jié)果：多糖保留率（91.56±0.78）%，蛋白去除率（49.91±0.37）%，脫色率（39.99±0.52）%，加權(quán)值為63.59%，與預(yù)期值比較誤差為0.86%，相對誤差較小，表明該回歸模型具有較好的預(yù)測性能。

3 結(jié)論

本文采用熱水浸提法與超聲波輔助水提法提取諾麗鮮果粗多糖，得出超聲波輔助水提法能有效增加粗多糖提取含量，多糖含量達(dá)到（14.72±1.48）mg/g。選用D-301大孔樹脂對諾麗粗多糖進(jìn)行初步除雜純化，通過試驗表明料液比、pH值和溫度對大孔樹脂的吸附效果有顯著影響。確定D301-R型大孔樹脂對諾麗粗多糖脫色除蛋白的最佳工藝參數(shù)為料液比0.17 g/mL，pH5.00，溫度49℃。此工藝條件下，多糖保留率（91.56±0.78）%，蛋白去除率（49.91±0.37）%，脫色率（39.99±0.52）%，加權(quán)值為63.59%，與預(yù)期值相差為0.86%。此響應(yīng)面建立的回歸模型具有良好的預(yù)測性和可行性，希望此試驗方法為進(jìn)一步研究諾麗多糖和開發(fā)諾麗產(chǎn)品有所助益。