陳暉，陸道禮，陳斌

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

我國(guó)是食用植物油消費(fèi)大國(guó)[1]。食用植物油除了給機(jī)體提供生長(zhǎng)代謝所需要的能量外，還能提供重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如必需脂肪酸、植物甾醇、維生素E及酚類化合物等[2,3]。目前，由于各種食用植物油之間的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和市場(chǎng)認(rèn)可度等存在差異，因此不同種類的食用植物油價(jià)格往往存在較大差異。以山茶油為例，近年來(lái)對(duì)其成分的研究表明，其脂肪酸組成接近橄欖油，而且由于其飽含對(duì)人體健康有益的維生素E、茶多酚和角鯊烯等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其價(jià)格往往高于一般的食用植物油[4～8]。另外，由于產(chǎn)地之間的差別，不同山茶油之間的認(rèn)可度也不盡相同。例如，浙江常山的山茶油由于其獨(dú)特的品質(zhì)，已經(jīng)注冊(cè)成為地理標(biāo)志產(chǎn)品。受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使和生活水平提高的影響，國(guó)內(nèi)關(guān)于食用植物油品質(zhì)的問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮，且人們對(duì)于食用植物油產(chǎn)地的偏好已經(jīng)形成[9～11]。實(shí)際生活中，消費(fèi)者通常只能根據(jù)感官對(duì)不同種類的食用植物油進(jìn)行判斷，而涉及到不同產(chǎn)地的同種食用植物油識(shí)別時(shí)，受限于個(gè)體的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和判別能力，其產(chǎn)地識(shí)別率往往不高。因此食用植物油產(chǎn)地的準(zhǔn)確、快速識(shí)別方法的建立顯得尤為重要[12]。

熒光技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析是一種快速、靈敏的食用植物油識(shí)別分析方法[13,14]。然而，食用植物油中的熒光信號(hào)往往被高濃度熒光分子主導(dǎo)，低濃度熒光分子信號(hào)經(jīng)?！把蜎](méi)”在高濃度熒光分子信號(hào)中。這一現(xiàn)象在穩(wěn)態(tài)熒光測(cè)量中十分明顯，通常引起熒光譜指紋性下降，并將最終導(dǎo)致產(chǎn)地識(shí)別模型性能的下降。相較于穩(wěn)態(tài)熒光測(cè)量，時(shí)間分辨熒光測(cè)量提供了熒光發(fā)射的動(dòng)態(tài)信息，檢測(cè)時(shí)不易受熒光分子濃度干擾，因而受到廣泛關(guān)注[15～18]。熒光衰減是停止激發(fā)后熒光強(qiáng)度減弱的動(dòng)態(tài)過(guò)程，不同的熒光分子擁有其對(duì)應(yīng)的本征熒光衰減，因此更具指紋性[19]。所以，基于熒光衰減測(cè)量的時(shí)間分辨熒光發(fā)射譜（TRFES）更契合產(chǎn)地識(shí)的要求。

本研究的目的在于利用 TRFES對(duì)山茶油產(chǎn)地進(jìn)行識(shí)別研究，選用浙江、江西和湖南3個(gè)產(chǎn)地的山茶油為研究對(duì)象，通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取 TRFES中的有效信息并建立產(chǎn)地識(shí)別模型，為食用植物油產(chǎn)地識(shí)別提供新的方法和思路，加深對(duì)時(shí)間分辨熒光技術(shù)的理解。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

收集浙江、江西、湖南的山茶油油料籽各60份，總計(jì)180份，去殼烘干作為榨油原料。為排除工藝等因素對(duì)山茶油樣品的影響，所有山茶油樣品均采用物理冷榨方式獲得。正己烷（分析純），鎮(zhèn)江華東器化玻有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

油夫人(YFR) WMTL-A3智能榨油機(jī)，唯美天麗電器有限公司；TenPro 3時(shí)間分辨熒光儀（配備370 nm LED激發(fā)器和TBX-07C檢測(cè)器），HORIBA公司；Frontier 5000 Multi Pro多功能離心機(jī)，OHAUS公司。

1.3 樣品制備與TRFES采集

1.3.1 山茶油樣品的制備

山茶油樣品制備的工藝流程：山茶籽挑選脫殼，采用榨油機(jī)進(jìn)行壓榨，毛油經(jīng)過(guò) Frontier 5000 Multi Pro多功能離心機(jī)3000 r/min，5 min離心，離心后靜置10 min取上層油樣作為試驗(yàn)用山茶油樣品。

1.3.2 山茶油樣品TRFES的采集

試驗(yàn)采用HORIBA TenPro 3時(shí)間分辨熒光光譜儀（配備時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器）采集TRFES。首先以二氧化硅散射溶液作為儀器響應(yīng)函數(shù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定儀器，儀器標(biāo)定以采集到二氧化硅散射溶液在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm處的熒光光子數(shù)到達(dá)10000為止（Peak Press）。設(shè)定TenPro 3時(shí)間分辨熒光儀在下列條件下采集3個(gè)產(chǎn)地山茶油的TRFES，具體檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)：370 nm；光譜采集范圍：380～600 nm；波長(zhǎng)間隔：5 nm；積分時(shí)間：10 s；采集時(shí)間范圍：0～200 ns；提取信號(hào)時(shí)間范圍：55～60 ns；時(shí)間分辨率：0.05 ns；出入射狹縫寬度：2 nm。

山茶油樣品 TRFES的采集：將待測(cè)油樣裝于光程為10 mm的四通石英比色皿中，以TenPro 3時(shí)間分辨熒光儀在上述檢測(cè)參數(shù)條件下進(jìn)行 TRFES光譜數(shù)據(jù)的采集，每個(gè)油樣重復(fù)3次試驗(yàn)，油樣測(cè)定完成后用正己烷清洗比色皿，然后進(jìn)行下個(gè)油樣的 TRFES光譜的采集。利用 DAS6軟件進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，Matlab數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)所得光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.3 山茶油樣品特征波長(zhǎng)熒光衰減分析

為說(shuō)明 TRFES的強(qiáng)指紋性，結(jié)合課題組之前的預(yù)備試驗(yàn)分析，特選取山茶油樣品在410 nm處的熒光衰減進(jìn)行深入分析。通常，能夠從熒光衰減獲得的特征參數(shù)為熒光壽命，它是熒光分子的本征參數(shù)，表明熒光分子衰減的平均時(shí)間，和熒光分子濃度無(wú)關(guān)，決定于分子的種類。一般來(lái)說(shuō)，熒光壽命不同，則表明分子種類不同；不同種類的熒光分子雖然在熒光發(fā)射譜中發(fā)射峰位可能相同，但是由于其壽命的不同，會(huì)造成該波長(zhǎng)處熒光衰減形式與熒光衰減時(shí)間不同；而熒光衰減時(shí)間和熒光壽命一樣不受分子濃度影響，因此通過(guò)分析熒光壽命，可以證明 TRFES的強(qiáng)指紋性。

為獲得山茶油樣品在410 nm處的熒光壽命，對(duì)其410 nm處的熒光衰減進(jìn)行了測(cè)定和分析，具體檢測(cè)條件為：二氧化硅散射溶液作為儀器響應(yīng)函數(shù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定儀器，370 nm激發(fā)波長(zhǎng)處峰值光子數(shù)（Peak Press）為10000；激發(fā)波長(zhǎng)：370 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：410 nm；410 nm發(fā)射波長(zhǎng)處峰值光子數(shù)（Peak Press）為10000；出入射狹縫寬度：2 nm；激發(fā)速率：1 MHz。采用DAS6軟件進(jìn)行熒光衰減譜擬合并計(jì)算熒光壽命，擬合優(yōu)度卡方低于1.05時(shí)為可接受的擬合。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 光譜預(yù)處理

在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前，采用標(biāo)準(zhǔn)正交變化（SNV）算法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，以排除基線漂移的影響；然后，采用5點(diǎn)窗口的Savitzky-Golay平滑算法進(jìn)行處理，以降低光譜噪聲的影響。

1.4.2 PARAFAC分析

平行因子分析（PARAFAC）是一種多維數(shù)據(jù)分析方法，它可以被理解為高維的主成分分析（PCA），分析后得到的因子得分可以進(jìn)一步進(jìn)行回歸分析、判別分析等[20,21]。在應(yīng)用PARAFAC分析前，將訓(xùn)練集樣品的TRFES組成一個(gè)三維矩陣Z。訓(xùn)練集樣品的總數(shù)為150（浙江、江西、湖南的山茶油樣本各50個(gè)）；TRFES采集范圍：380～600 nm，間隔為5 nm；有效信號(hào)時(shí)間范圍：55～60 ns，時(shí)間分辨率：0.05 ns。因此三維矩陣Z的結(jié)構(gòu)為150×44×100。三維矩陣Z建立后，再進(jìn)行PARAFAC分析。

在PARAFAC分析過(guò)程中，首先采用核一致性分析方法判斷模型的有效因子數(shù)，然后在這些因子構(gòu)建的空間中對(duì)三維矩陣Z進(jìn)行擬合，得到擬合因子的載荷向量和得分向量，最后將因子的得分向量作為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法（ANN）的輸入建立產(chǎn)地識(shí)別模型。

1.4.3 山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型的建立

選擇ANN算法建立山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型，采用交叉驗(yàn)證和外部驗(yàn)證檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷淖R(shí)別能力。訓(xùn)練集樣品總數(shù)為150個(gè)（浙江、江西、湖南的山茶油樣本各50個(gè)），預(yù)測(cè)集樣本總數(shù)為30個(gè)（浙江、江西、湖南的山茶油樣本各10個(gè)）。計(jì)算山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型的校正均方根誤差（RMSEC）、交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）和預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP），以及對(duì)應(yīng)的校正相關(guān)系數(shù)（R2c）、交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（R2cv）和預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)（R2 p），用以評(píng)價(jià)模型的性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同產(chǎn)地山茶油的TRFES分析

TRFES可以從光譜與時(shí)間兩個(gè)維度提供熒光信息，因此以下分析從這兩個(gè)方面進(jìn)行。從光譜維度觀測(cè)TRFES時(shí)，相當(dāng)于觀測(cè)某一“時(shí)間切片”下的穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射。圖1a為山茶油TRFES在56 ns時(shí)刻的熒光發(fā)射譜。從譜中可以看出，浙江、江西和湖南的山茶油樣品熒光發(fā)射譜峰位、峰強(qiáng)相似，表明利用穩(wěn)態(tài)熒光很難區(qū)分不同產(chǎn)地的山茶油。由穩(wěn)態(tài)熒光測(cè)量的原理可知，某波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度是所有在該波長(zhǎng)下熒光分子發(fā)射熒光的疊加。這一疊加忽略了熒光發(fā)射的過(guò)程差異而導(dǎo)致時(shí)間平均效應(yīng)的產(chǎn)生，這導(dǎo)致不同產(chǎn)地山茶油穩(wěn)態(tài)熒光缺乏指紋性，而指紋性的缺乏必將導(dǎo)致基于穩(wěn)態(tài)熒光測(cè)量的山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型識(shí)別能力的下降。

圖1 山茶油的熒光發(fā)射譜(a)和熒光衰減譜(b)Fig.1 Fluorescence emission spectra (a) and fluorescence decay spectra (b) of camellia oils

圖2 山茶油TRFESFig.2 TRFES of camellia oils

圖1b為山茶油TRFES特征波長(zhǎng)（410 nm）處的熒光衰減譜。從譜中可以看出，雖然在特征波長(zhǎng)處 3個(gè)產(chǎn)地的山茶油熒光發(fā)射峰強(qiáng)幾乎相同，但是它們的衰減表現(xiàn)出了不同的形式。熒光衰減時(shí)間：江西<浙江<湖南，這表明湖南山茶油中某熒光分子的壽命要長(zhǎng)于浙江和江西山茶油。表1為3個(gè)產(chǎn)地山茶油410nm處熒光衰減分析結(jié)果。從表1可以看出，3個(gè)產(chǎn)地山茶油中均存在三類壽命分子，它們之間的熒光壽命差異較大。3個(gè)產(chǎn)地山茶油熒光分子最大熒光壽命（T3）：江西<浙江<湖南，和圖1b熒光衰減譜的衰減時(shí)間一致。由于熒光壽命是熒光分子的本征參數(shù)，決定于分子的種類，反映在熒光衰減上，因此熒光衰減的差異也可體現(xiàn) 3種植物油熒光分子組成的本質(zhì)差異，且這種差異更具指紋性，因此更契合食用植物油產(chǎn)地識(shí)別的要求。

圖2為三種山茶油的TRFES等高線圖。從TRFES中可以看出，浙江、江西、湖南山茶油之間的熒光發(fā)射強(qiáng)度接近，而熒光衰減差異較大。具體表現(xiàn)為，在400～550 nm范圍內(nèi)，熒光衰減時(shí)間：江西<浙江<湖南。TRFES從多個(gè)波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)了山茶油的熒光衰減，并顯示出極強(qiáng)的指紋性，針對(duì)這一指紋性極強(qiáng)的多波長(zhǎng)熒光衰減進(jìn)行分析在提高食用植物油產(chǎn)地識(shí)別率中顯得尤為有效。因此，分析認(rèn)為基于多波長(zhǎng)熒光衰減測(cè)量的TRFES更能反映食用植物油這一類復(fù)雜體系的指紋特征，從而更加契合產(chǎn)地識(shí)別這類要求強(qiáng)指紋性的分析任務(wù)。

表1 3個(gè)產(chǎn)地山茶油410 nm熒光衰減分析結(jié)果Table 1 The results of fluorescence decay at 410 nm of 3 geographical camellia oils

2.2 PARAFAC結(jié)果分析

圖3 核一致性分析結(jié)果Fig.3 Results of core consistence analysis

圖3為PARAFAC核一致性分析結(jié)果圖。由圖3可知，選用2個(gè)因子（核一致性大于99.9%）即可成功地對(duì)山茶油的三維矩陣Z進(jìn)行分解。這一結(jié)果也表明PARAFAC可以成功地應(yīng)用于TRFES的分解。

圖4 山茶油平行因子得分Fig.4 PARAFAC scores of camellia oils

圖4為3個(gè)產(chǎn)地山茶油的平行因子得分圖。由圖4可知，3個(gè)產(chǎn)地山茶油的TRFES經(jīng)過(guò)PARAFAC分析后，可以較好地被預(yù)分離。其中浙江山茶油和江西山茶油、湖南山茶油在平行因子得分圖中的位置相距較遠(yuǎn)，表明浙江山茶油的組成和江西山茶油、湖南山茶油差異較大；江西山茶油和湖南山茶油在平行因子得分圖中的位置接近，這可能是由于這兩地地緣相近導(dǎo)致山茶油成分接近所致。另外，湖南山茶油組內(nèi)樣品在平行因子得分圖中的跨度也很大，這可能和湖南省內(nèi)山茶生長(zhǎng)環(huán)境差異有關(guān)。

2.3 山茶油ANN產(chǎn)地識(shí)別模型的建立

山茶油TRFES經(jīng)PARAFAC分析后，采用平行因子得分作為ANN的輸入建立山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型。訓(xùn)練集樣品總數(shù)為 150（浙江山茶油、江西山茶油和湖南山茶油各50個(gè)），預(yù)測(cè)集樣本總數(shù)為30個(gè)（浙江山茶油、江西山茶油和湖南山茶油各10個(gè)），產(chǎn)地識(shí)別模型性能評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示。由表2可知，山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)R2cv為98.7%，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2 p為96.1%，表明山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型穩(wěn)健可靠，產(chǎn)地預(yù)測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，可以實(shí)現(xiàn)3個(gè)產(chǎn)地山茶油的準(zhǔn)確、快速識(shí)別。

表2 山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 2 Statistics for geographical identification model of camellia oil

3 結(jié)論

本文采用TRFES技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立了一種準(zhǔn)確、快速的山茶油產(chǎn)地識(shí)別方法。相較于穩(wěn)態(tài)熒光，熒光衰減受熒光分子濃度影響較小因此更具指紋性，因此 TRFES更加契合諸如產(chǎn)地識(shí)別等要求強(qiáng)指紋性的任務(wù)。山茶油TRFES經(jīng)PARAFAC分析后最終建立了山茶油產(chǎn)地識(shí)別模型，模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)為98.7%，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)為96.1%，表明該模型穩(wěn)健、準(zhǔn)確，適合進(jìn)行山茶油產(chǎn)地識(shí)別。綜上分析得出，通過(guò)對(duì) TRFES這一指紋性極強(qiáng)的動(dòng)態(tài)熒光譜進(jìn)行分析，可以完成對(duì)山茶油產(chǎn)地的準(zhǔn)確、快速識(shí)別。