李俊星,鐘玉娟,羅劍寧,王雯雯,黃文潔,史敬芳,黃河勛
(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,廣東廣州 510640)(2.廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510640)(3.安捷倫科技(中國(guó))有限公司,北京 100102)(4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心,廣東廣州 510640)
南瓜為葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(Cucurbita)的一類重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物,中國(guó)南瓜(Cucurbita moschata)、印度南瓜(Cucurbita maxima)和美洲南瓜(Cucurbita pepo)是3個(gè)常見的具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的栽培種。盡管南瓜種類較多,但是絕大多數(shù)南瓜果實(shí)風(fēng)味不太吸引人。近年來,育種者選育出一類具有濃郁香味特征的南瓜品種-香芋南瓜,在田間或蒸煮過程中能散發(fā)出令人愉悅的類似芋香味,因此,香芋南瓜是進(jìn)行南瓜香味性狀研究的理想材料。果實(shí)香氣成分的綜合分析能客觀地反映不同果實(shí)的風(fēng)味特點(diǎn),是果實(shí)特征品質(zhì)的重要指標(biāo)[1],目前,國(guó)內(nèi)外針對(duì)南瓜新鮮果實(shí)、南瓜汁、南瓜籽以及南瓜籽油的香氣物質(zhì)研究已見報(bào)道,由于供試材料的差異,香氣組分結(jié)果也不盡相同[2~6]。中國(guó)南瓜(蜜本)果實(shí)共鑒定44種化合物,主要由烯類、醇類、酯類和醛類等物質(zhì)構(gòu)成,而印度南瓜(錦栗)果實(shí)共鑒定51種化合物,以羧基類、醇類、烷烴類為主,還有部分雜環(huán)類物質(zhì)[5]。因此,針對(duì)不同的供試材料,要充分了解其香氣揮發(fā)物的組成和含量,才能夯實(shí)香芋南瓜風(fēng)味性狀的基礎(chǔ)工作。
對(duì)于香氣物質(zhì)研究的主要手段有電子鼻、氣相色譜以及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。電子鼻是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種實(shí)現(xiàn)快速分析氣味的儀器,具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),是用于快速判斷氣味狀況的便攜裝置[7,8]。電子鼻的分析結(jié)果呈現(xiàn)“模糊評(píng)價(jià)”特征,是對(duì)樣本整體香味特征進(jìn)行比較,但是無法明晰具體的揮發(fā)性物質(zhì)成分。對(duì)于具體揮發(fā)性成分的鑒定,揮發(fā)性物質(zhì)的分離提取以及定性定量分析是其關(guān)鍵所在。目前香氣研究常采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(Headspace-solid phase micro/extraction combined with gas chromatographymass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)。HS-SPME 提取技術(shù)已在柑橘[9,10]、草莓[11]等果實(shí)的香氣研究中得到了廣泛應(yīng)用。揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定由定性和定量分析組成,通過GC-MS可以有效鑒別大量揮發(fā)性物質(zhì),同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析,極大地推動(dòng)了香氣研究。近年來GC-MS已廣泛用于蘋果[12]、芒果[13]以及桃[14]等果實(shí)香氣物質(zhì)的檢測(cè)與鑒別研究。盡管GC-MS技術(shù)能夠?qū)颖局械膿]發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析,但不能分析這些物質(zhì)作為一個(gè)整體時(shí)對(duì)樣本風(fēng)味的貢獻(xiàn)。因此,通過電子鼻和GC-MS的配合利用有利于從宏觀和微觀上全面研究供試樣本的風(fēng)味特征[15]。
因此,本研究以香芋南瓜成熟果實(shí)為研究材料,以非香芋南瓜為對(duì)照材料,首先利用電子鼻技術(shù)從整體風(fēng)味進(jìn)行比較分析;其次利用 HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)種類以及含量進(jìn)行分析,通過不同南瓜材料的差異化合物分析初步明確香芋南瓜特有香氣組分,并分析了特有香氣成分在香芋南瓜果實(shí)不同發(fā)育階段含量變化。研究結(jié)果對(duì)香芋南瓜香味種質(zhì)資源挖掘和精準(zhǔn)鑒定、優(yōu)良品種選育以及南瓜產(chǎn)品的深加工均有重要的指導(dǎo)意義。
1.1.1 材料與試劑
本研究所用的植物材料都為本課題組自行選育,種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云基地。香芋南瓜材料編號(hào)為YJ,2類非香芋南瓜編號(hào)分別為EY和278,都為中國(guó)南瓜類型。化學(xué)試劑:C7~C40飽和正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó) Supleco公司;3-壬酮,Alfa Aesar公司。
1.1.2 儀器與設(shè)備
PEN3電子鼻,德國(guó)AIRSENSE公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,美國(guó)Supleco公司;20 mL螺口頂空瓶,7890B氣相色譜串聯(lián) 7000D質(zhì)譜儀,7890A氣相色譜串聯(lián)5975C質(zhì)譜儀,美國(guó)安捷倫公司。
1.2.1 樣本采集及預(yù)處理
供試南瓜品種于成熟期(授粉后約45 d)各3次生物學(xué)重復(fù)取樣,成熟果實(shí)取材于2016年11月。香芋南瓜不同發(fā)育階段果實(shí)取材于2017年5~7月,在YJ未授粉(W)、授粉后25天(25 d)以及授粉后55天(55 d)三個(gè)階段進(jìn)行取樣,各個(gè)取樣時(shí)間3次生物學(xué)重復(fù)。取樣切片后立即液氮冷凍,放置-80 ℃保存。將-80 ℃保存的果實(shí)樣本進(jìn)行冷凍干燥。待干燥充分后,將樣本研磨成粉,得到樣本干燥的粉樣,用于后期檢測(cè)。
1.2.2 電子鼻檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)采用PEN3電子鼻采集YJ和EY兩類南瓜資源的仿生嗅覺數(shù)據(jù)。傳感器列陣包含10個(gè)對(duì)不同類型氣體揮發(fā)物敏感的金屬氧化物氣敏傳感器,使得電子鼻系統(tǒng)能夠檢測(cè)不同的氣味。電子鼻采樣前,將每個(gè)重復(fù)10 g量放入100 mL燒杯中,密封,靜置1.5 h后采用電子鼻對(duì)其頂空氣體進(jìn)行進(jìn)樣。燒杯使用前均用超聲波清洗儀洗凈,放置陰涼、無異味的室內(nèi)環(huán)境晾干。電子鼻的采樣參數(shù)設(shè)置為:采樣時(shí)間間隔1 s,傳感器自動(dòng)清洗時(shí)間100 s,傳感器歸零時(shí)間3 s,分析采樣時(shí)間 100 s,進(jìn)樣準(zhǔn)備時(shí)間 3 s,進(jìn)樣流量 190 mL/min。隨后提取電子鼻各傳感器特征值,利用PEN3傳感器配套的Winmuster軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和線性判別分析(Linear Discriminant Analysis,LDA)。
1.2.3 GC-MS檢測(cè)的香氣物質(zhì)的提取
準(zhǔn)確稱取1 g粉狀樣品,放入20 mL頂空瓶中,加入 1 μL 3-壬酮(0.04 μg/μL)作為內(nèi)標(biāo),迅速擰緊頂空瓶瓶蓋,放入70 ℃水浴中。迅速插入固相微萃取裝置,平衡2 min,70 ℃吸附35 min。
1.2.4 香氣物質(zhì)的GC-MS檢測(cè)
吸附后,把萃取頭插入GC-MS的色譜儀的進(jìn)樣口進(jìn)行解吸附,進(jìn)樣口溫度為270 ℃,解吸附時(shí)間為4.5 min。香芋南瓜成熟果實(shí)香氣物質(zhì)分析利用7890B氣相色譜串聯(lián)7000D質(zhì)譜儀對(duì)樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。不同發(fā)育階段果實(shí)香氣物質(zhì)采集和分析利用7890A氣相色譜串聯(lián)5975C質(zhì)譜儀。
氣相條件:氣相色譜柱 DB-5MS;載氣為氦氣(99.999%),流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣模式為SPME手動(dòng)進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度為270 ℃;程序化升溫:50 ℃保持3 min,隨后以5 ℃/min的速率上升至250 ℃,保持5 min。質(zhì)譜條件:EI離子源;電離電壓70 eV;離子源溫度 230 ℃;四級(jí)桿溫度 150 ℃;接口溫度280 ℃;掃描模式為全掃,m/z35~450。
1.2.5 GC-MS數(shù)據(jù)分析
首先利用Masshunter定性分析軟件對(duì)香芋南瓜成熟果實(shí)采集到的全掃數(shù)據(jù)進(jìn)行解卷積,在NIST 14標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中進(jìn)行檢索,并根據(jù)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品(C7-C40)提供的可靠信息計(jì)算保留指數(shù),對(duì)鑒定得到的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析,標(biāo)準(zhǔn)為:(1)NIST14庫(kù)比對(duì),質(zhì)譜匹配得分總分在70分以上;(2)保留指數(shù)偏差在10以內(nèi),各化合物理論保留指數(shù)來自NIST 14庫(kù)。獲得香芋南瓜成熟果實(shí)的揮發(fā)性組分,揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量,即通過各物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值計(jì)算的半定量估值。
香芋南瓜與非香芋南瓜果實(shí)中揮發(fā)性化合物的差異分析按如下步驟分析。首先利用Masshunter定性分析軟件進(jìn)行解卷積。解卷積條件:保留時(shí)間窗口比例系數(shù):100;信噪比閾值:2.0;剔除m/z為28的化合物。解卷積后的數(shù)據(jù)保存為.cef文件導(dǎo)入分析軟件Mass Profiler Professional(MPP)中進(jìn)行分析,MPP化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件對(duì)香芋南瓜和非香芋南瓜的果實(shí)GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和統(tǒng)計(jì)分析。利用過濾后的揮發(fā)性化合物通過MPP軟件進(jìn)行主成分分分析(Principle Component Analysis,PCA),綜合反映不同樣本間的揮發(fā)性物質(zhì)差異。通過統(tǒng)計(jì)分析獲得差異化合物,對(duì)差異化合物進(jìn)行定性,鑒定香芋南瓜成熟果實(shí)中的特有化合物。MPP過濾參數(shù):最小絕對(duì)豐度:5000;組內(nèi)化合物最小出現(xiàn)頻率:60%;組內(nèi)最大變異系數(shù):30%;統(tǒng)計(jì)分析參數(shù):p<0.05;最小差異倍數(shù):2。
香芋南瓜果實(shí)的特有化合物在果實(shí)不同發(fā)育階段中的相對(duì)含量分析,以內(nèi)標(biāo)峰面積為參考,計(jì)算其相對(duì)含量(mg/kg干重)。
圖1 電子鼻對(duì)香芋南瓜和非香芋南瓜識(shí)別的PCA和LDA分析Fig.1 Electronic nose detection for Xiangyu pumpkin and non-Xiangyu pumpkin based on PCA and LDA
利用電子鼻從整體香味水平上對(duì)香芋南瓜和非香芋南瓜進(jìn)行模糊評(píng)價(jià)。圖1為電子鼻對(duì)不同南瓜香味識(shí)別的PCA和LDA分析結(jié)果,通過PCA分析,其中第一主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率 85.00%,第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為 6.16%,前兩個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到91.16%。隨后LDA分析結(jié)果顯示第1線性判別因子LD1的貢獻(xiàn)率為99.67%,第2線性判別因子LD2的貢獻(xiàn)率為0.04%,第1、2線性判別因子的累積貢獻(xiàn)率為99.71%。香芋南瓜YJ和非香芋南瓜EY樣本數(shù)據(jù)點(diǎn)之間無重疊,可以較好地進(jìn)行識(shí)別分類。
利用GC-MS對(duì)香芋南瓜種質(zhì)YJ成熟果實(shí)的揮發(fā)性成分進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析,總離子色譜圖如圖2所示。經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和保留指數(shù)計(jì)算,共定性鑒別獲得了香氣物質(zhì)31種,其保留指數(shù)、相對(duì)含量、定性結(jié)果均列于表1。
從化合物分類上看,31種化合物主要包括醛、醇、酮、酯、含氮化合物、內(nèi)酯、苯及烯類等物質(zhì),其中醛類物質(zhì)最多達(dá)到12種,總相對(duì)含量為0.0398 mg/kg干重,其次為酮類、含氮化合物和醇類,分別為6種、4種和4種,總相對(duì)含量分別為0.0044、0.0163和0.0050 mg/kg干重。
從單個(gè)化合物含量上來看,反式-2-己烯醛含量最高為0.0182 mg/kg干重,其次為2-乙?;?1-吡咯啉,相對(duì)含量為0.0133 mg/kg干重。
圖2 香芋南瓜果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖Fig.2 Representative GC-MS total ion chromatograms of volatile compounds from Xiangyu pumpkin
表1 香芋南瓜成熟果實(shí)中揮發(fā)性成分概括表Table 1 The volatile compounds in mature fruit of Xiangyu pumpkin
注:相對(duì)含量為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。
圖3 不同樣本揮發(fā)性化合物主成分分析Fig.3 Score plot of principal compounds analysis using aroma compounds from different samples
分別收集香芋南瓜(YJ)和2類非香芋南瓜(EY和278)成熟果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì),采集數(shù)據(jù)通過MPP分析軟件進(jìn)行過濾及統(tǒng)計(jì)分析,將所得的差異化合物利用質(zhì)譜圖和保留指數(shù)進(jìn)行定性。結(jié)果表明,YJ與EY相比較,兩者之間的揮發(fā)性成分通過PCA主成分分析,PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為58.24%和19.91%(圖3)。最終獲得15種差異化合物,其中能定性10種化合物。YJ與278相比較,PCA結(jié)果表明其能解釋78.78%的變異(圖3)。獲得6種差異化合物,鑒定出3種差異化合物。
總體而言,主成分能夠充分保存樣品的原始數(shù)據(jù)信息,通過揮發(fā)性成分的PCA分析香芋南瓜和2類非香芋南瓜能夠較好地區(qū)分,說明香芋南瓜和非香芋南瓜果實(shí)之間存在揮發(fā)性物質(zhì)差異。YJ與EY之間10種差異化合物中有6種揮發(fā)性物質(zhì)僅在香芋南瓜果實(shí)中被檢測(cè)到,包括2-乙?;?1-吡咯啉、2-乙?;量ⅵ?紫羅酮、反式6-壬烯醛、2,6-二甲基環(huán)己醇和a-紫羅酮(表2),而YJ與278之間的3種差異化合物有2種香芋南瓜特有的揮發(fā)性物質(zhì),包括2-乙?;?1-吡咯啉和苯甲醛。綜上分析,在兩組比較分析中,2-乙?;?1-吡咯啉(2-AP)是兩個(gè)比較組中共有的差異香氣成分。
表2 香芋南瓜與非香芋南瓜相比特有的揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 The unique volatile compounds in Xiangyu pumpkin compared with non-Xiangyu pumpkin
以3個(gè)果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期樣本為試驗(yàn)材料,分析了2-乙?;?1-吡咯啉在不同發(fā)育階段的含量。結(jié)果表明,隨著果實(shí)成熟,2-乙?;?1-吡咯啉呈下降趨勢(shì),該物質(zhì)在W和25 d的果實(shí)中含量相差不顯著,分別為0.0500和0.0500 mg/kg干重,但是在果實(shí)成熟后期55 d,該物質(zhì)含量降低顯著,為0.0200 mg/kg干重(圖4)。
圖4 果實(shí)不同發(fā)育階段2-乙?;?1-吡咯啉含量變化示意圖Fig.4 The abundance of 2-AP in the different development stage of fruit
3.1 香芋南瓜具有特殊的濃郁香味,是一類適宜進(jìn)行南瓜香味性狀分析的試驗(yàn)材料。本研究利用了電子鼻技術(shù)的模糊評(píng)價(jià)特征,以及GC-MS技術(shù)對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)精確鑒定的特性,綜合兩者的檢測(cè)結(jié)果,客觀判定香芋南瓜果實(shí)與非香芋南瓜果實(shí)的香味性狀差異。在前人研究中,利用電子鼻技術(shù)也能夠較好的區(qū)分中國(guó)南瓜、印度南瓜和美洲南瓜這三類南瓜資源[5],說明其是一種比較有效的區(qū)分南瓜資源不同香味的分析手段。本研究的電子鼻PCA分析中,兩樣本間數(shù)據(jù)點(diǎn)無重疊(圖1),充分說明兩者之間整體風(fēng)味有顯著差異,電子鼻技術(shù)對(duì)于香芋南瓜與非香芋南瓜的區(qū)分效果是明顯的。
3.2 南瓜果實(shí)香氣物質(zhì)是由不同揮發(fā)性物質(zhì)組成的混合物,主要包括酯類、醛類、醇類、酸類、萜類和酮類等化合物[5]。本試驗(yàn)采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)香芋南瓜成熟果實(shí)中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,共鑒定出31種揮發(fā)性物質(zhì)。其中醛類物質(zhì)種類及含量均為最高,醛類物質(zhì)具有較低的閾值,對(duì)風(fēng)味影響較大。醛類物質(zhì)中含量最高的為反式-2-己烯醛,具有清香味(http://www.flavornet.org/),C6 以及 C9 的醇醛類物質(zhì)是清香型化合物的代表[16]。醛類物質(zhì)中的反,順-2,6-壬二烯醛是黃瓜特征香氣的最重要物質(zhì)[17],具有強(qiáng)烈的紫羅蘭和黃瓜似香氣。含氮化合物中最重要的物質(zhì)是2-乙?;?1-吡咯啉,該化合物為香稻的特征香氣成分[18],其在較低的含量時(shí)就能體現(xiàn)出強(qiáng)烈的風(fēng)味,呈現(xiàn)典型的花香、甜香,也有報(bào)道描述為典型的爆米花氣味。該物質(zhì)在南瓜子油中也被檢測(cè)到,并且呈現(xiàn)最高的風(fēng)味稀釋因子(flavor dilution factor)[3],這說明在 2-乙?;?1-吡咯啉是這類特定南瓜子油的主要香味貢獻(xiàn)物。香芋南瓜果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的種類與含量鑒定結(jié)果與前人研究結(jié)果相比較有比較大的差異,周春麗等[5]對(duì)中國(guó)南瓜(蜜本南瓜)的香氣物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)含量最高的為酯類和醇類化合物,且并沒有檢測(cè)到含氮化合物,這可能是與香芋南瓜獨(dú)特的濃郁香味有關(guān)在果實(shí)眾多香氣物質(zhì)中,一種或幾種關(guān)鍵揮發(fā)性化合物賦予特殊的香味屬性,稱之為香味主要貢獻(xiàn)物,這些成分對(duì)果實(shí)風(fēng)味其主要作用[19]。因此,從諸多揮發(fā)性物質(zhì)中鑒定出香芋南瓜成熟果實(shí)香味主要貢獻(xiàn)物,對(duì)后續(xù)香芋南瓜香味性狀的解析至關(guān)重要。本研究通過比較香芋南瓜和非香芋南瓜成熟果實(shí)的揮發(fā)性成分,利用化學(xué)計(jì)量學(xué)首先對(duì)二者的化合物進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和統(tǒng)計(jì)分析,得到香芋南瓜果實(shí)中特有的揮發(fā)性化合物。該技術(shù)的運(yùn)用對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的過濾,保證了最終用于分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性,并且相較前人研究減輕了化合物定性分析的工作量,只需對(duì)差異化合物進(jìn)行定性。另外,主成分分析(PCA)的結(jié)果表明揮發(fā)性化合物能很好的將香芋南瓜和非香芋南瓜進(jìn)行區(qū)分(圖3),并且貢獻(xiàn)率接近或達(dá)到80%,主成分能夠充分保存樣本的原始數(shù)據(jù)信息。GC-MS技術(shù)是對(duì)樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的具體種類和含量進(jìn)行檢測(cè)和比較,也顯示兩者之間揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量呈現(xiàn)顯著性不同,這一結(jié)果與電子鼻分析結(jié)果基本一致,GC-MS的分析結(jié)果有利于對(duì)電子鼻分析的結(jié)果解釋。
3.3 通過2組比較(表2),我們獲得2-乙酰基-1-吡咯啉為香芋南瓜果實(shí)特有的香氣物質(zhì),我們推測(cè)其為香芋南瓜的香味主要貢獻(xiàn)物。該物質(zhì)在非香芋南瓜成熟果實(shí)中都沒有檢測(cè)到,并且該化合物在香芋南瓜成熟果實(shí)的揮發(fā)性成分中含量非常高(表1)。此外,通過該化合物在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期研究發(fā)現(xiàn),其在未授粉果實(shí)中含量最高,在授粉25 d該化合物的含量基本不變,保持在較高的水平,這與大部分香氣物質(zhì)出現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育后期的結(jié)論有差異[20]。在大部分水果果實(shí)香氣研究中發(fā)現(xiàn),在果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期,主要香氣物質(zhì)含量存在顯著差異[21~24]。另外,本研究中發(fā)現(xiàn),2-乙?;?1-吡咯啉在授粉后55 d果實(shí)成熟后期中含量急劇降低,這與田間嗅覺經(jīng)驗(yàn)相匹配。2-乙酰基-1-吡咯啉在香芋南瓜果實(shí)中的變化趨勢(shì),與該物質(zhì)在香稻葉片中的研究結(jié)果一致,其在香稻葉片中表現(xiàn)為葉尖含量高于葉片基部,嫩葉含量明顯高于老葉含量[25]。這可能是由于伴隨著果實(shí)衰老,該化合物合成減少而揮發(fā)增加導(dǎo)致的。通過了解香芋南瓜果實(shí)中 2-AP在不同發(fā)育階段的含量,可為果實(shí)采摘時(shí)機(jī)的選擇提供理論基礎(chǔ)。