周冉冉，高虹，范秀芝，殷朝敏，陳浙婭，姚芬，史德芳,3

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064）（2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430064）（3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

香菇（Lentinus edodes），屬于真菌中的一種可食用菌，是世界第二大食用菌[1]。鮮香菇富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和一般蔬菜不含有的麥角甾醇，其中蛋白質(zhì)由18種氨基酸組成，并含有8種人體必需的氨基酸[2]。此外，其含有的香菇多糖具有多種生物活性，是目前已知的最強免疫增強劑之一[3]。香菇還具有降血脂和抗腫瘤的作用[4～6]。

隨著消費者對天然健康理念的認同和追求，目前，其消費模式已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，逐漸由干香菇向鮮香菇轉(zhuǎn)變。鮮香菇含90%左右的水分，其含水量極高，不同與農(nóng)產(chǎn)品的不同，由于沒有外皮保護，容易在采摘和運輸過程中容易受到機械損傷，采后菇體的呼吸作用及蒸騰作用旺盛，極易發(fā)生失水萎焉、皺縮、褐變和腐爛等品質(zhì)劣變現(xiàn)象[7]，因此，如何保持鮮香菇的食用品質(zhì)，延長貨架期是業(yè)界亟需解決的問題之一[8]。針對鮮香菇的這種特性，探究一種方便有效的保鮮方法十分必要。

目前鮮香菇的保鮮方法有低溫貯藏[9]、氣調(diào)包裝[10]，涂膜保鮮[11]和輻照[12]等。食品輻照處理是一種非熱型加工保鮮新技術(shù)，具有抑制發(fā)芽、推遲成熟、殺蟲、滅菌和延長貨架期等作用，廣泛運用于果蔬的加工、貯藏保鮮[13]。目前運用到的輻照包括鈷-60、銫-137產(chǎn)生的γ射線和電子加速器產(chǎn)生的低于100 MeV電子束射線。60Coγ射線輻照是一種物理保鮮方式，和傳統(tǒng)的熱加工殺菌方式相比，是一種冷殺菌方式[14,15]。食用菌在采后仍然有較強的生命活動，酶活是生命活動中最重要的活動，也是影響果蔬類食品保鮮效果的關(guān)鍵因素之一[16]。本文采用60Co-γ射線輻照處理鮮香菇，通過不同輻照劑量處理后在4±1 ℃、濕度為80±5%的環(huán)境下進行貯藏試驗，通過考察60Coγ的滅菌效果和對香菇硬度、色澤、相關(guān)酶活性的影響，確定出最佳輻照劑量，為鮮香菇輻照保鮮提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料處理

新鮮香菇，購于三友(隨州)食品有限公司。挑選大小均一，外觀一致，未開傘無機械損傷的新鮮香菇，將其分為4組，每組6袋，每袋10個。4組香菇分別做以下處理：（1）不做任何處理，作為對照組（CK）；（2）1 kGy60Coγ射線輻照；（3）1.5 kGy60Coγ射線輻照；（4）2 kGy60Coγ射線輻照。處理結(jié)束后放置4±1 ℃，濕度80±5%的環(huán)境中貯藏，分別在貯藏第0、4、8、12、16、20 d進行指標(biāo)測定。

1.2 試劑與儀器

磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP），蛋氨酸（MET），核黃素，EDTA二鈉，EDTA，硼酸，硼砂，平板計數(shù)培養(yǎng)基（PCA），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氮藍四唑（NBT），Sigma；二硫蘇糖醇（DTT），L-苯丙氨酸，上海麥克林生物化學(xué)有限公司；氧化型谷胱甘肽（GSSG），NADPH四鈉鹽，Biofroxx；β-疏基乙醇，西亞試劑；纖維素酶試劑盒，幾丁質(zhì)酶試劑盒，南京建成生物工程研究所。

TA-Txplus質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司；UV-1800紫外可見分光光度計，島津；H1650R型醫(yī)用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；伽馬射線輻照源，60Co源（裝源量25.5萬居里），湖北省輻照實驗中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物含量的測定

參照Jiang T等[17]的方法稍作改動。用平板計數(shù)培養(yǎng)基（PCA）培養(yǎng)嗜溫菌，培養(yǎng)條件為2 d，溫度為35±1 ℃；用PDA培養(yǎng)霉菌、酵母，培養(yǎng)條件為：5～7 d，溫度為 28±1 ℃。

1.3.2 硬度的測定

參照李志嘯等[18]的方法稍作改動。使用TA-Txplus質(zhì)構(gòu)儀對香菇進行硬度測定，選用 P/36R探頭。將香菇放置在操作臺上，探頭以5 mm/s的速度進行下壓，用最大力的峰值表示硬度。

1.3.3 色澤的測定

參照Jiang T[19]等的方法稍作改動。用CR-400色彩色差計對香菇的色澤（L*、a*、b*）進行測定，檢測香菇蓋縱切面正中點，平行測定三次。L*表示白色，L*值越小表示越黑：a*表示紅綠，值“+”為紅，“-”為綠；b*表示黃藍，值“+”為黃，“-”藍，每個香菇理想的顏色值是L0=97，a0=-2，b0=0。ΔE值表示與理想顏色值相比，香菇色澤變化的程度，用測得的L*、a*、b*計算ΔE值和褐變指數(shù)（BI），公式如下：

1.3.4 超氧化物歧化酶活性測定

參照曹建康[20]等的方法進行測定，取1 g樣品，加入3 mL提取緩沖液冰浴研磨，離心取上清。向試管中加入反應(yīng)液及酶液。2支空白管加入提取緩沖液代替酶液。試管混勻后，將其中一支空白管放置于暗處，其余試管置于4000 lx日光燈下反映15 min后立即置于暗處終止反應(yīng)，并于560 nm處測定吸光值。不照光照空白管做空白調(diào)零，SOD活性（U/g組織）計算公式如下：

其中：A0-照光空白管測定吸光度值；As-樣品管測定吸光度值；V-樣品提取液總體積；M-樣品的質(zhì)量。

1.3.5 谷胱甘肽還原酶活性測定

參照曹建康等[20]的方法進行測定，取1 g樣品，加入5 mL提取緩沖液冰浴研磨，離心取上清液酶液。向試管中加入反應(yīng)液和0.2 mL酶液。再加入40 μL 4 mmol/L NADPH溶液后立即混合計時，30 s后在340 nm處開始測定吸光度A1，每隔30 s測定一次，連續(xù)測定6次（A1～A6）。用蒸餾水進行空白調(diào)零，GR活性（U/g組織）計算公式如下：

其中：A1-反應(yīng)混合液吸光度初始值；A6-反應(yīng)混合液吸光度終止值；V-樣品提取液總體積；M-樣品的質(zhì)量。

1.3.6 苯丙氨酸解氨酶活性測定

參照曹建康等[20]的方法進行測定，取1 g樣品，加入5 mL提取緩沖液冰浴研磨，離心取上清液酶液低溫保存。向試管中加入3反應(yīng)液，放入37 ℃保溫10 min后加入0.5 mL酶液迅速混合并測定混合液在290 nm下的吸光值A(chǔ)0。將試管再放入37 ℃保溫60 min后，立即測定此時吸光值A(chǔ)1。蒸餾水作為空白調(diào)零，PAL活性（U/g組織）計算公式如下：

其中：V-樣品提取液總體積；M-樣品的質(zhì)量。

1.3.7 纖維素酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測定。按照纖維素酶試劑盒說明書進行操作，于 550 nm下測定樣品吸光度值。CL活性（U/g組織）計算公式如下：

其中：A1-樣品管測定吸光度值；Ac-對照管測定吸光度值；As-標(biāo)準(zhǔn)管測定吸光度值；A0-空白管測定吸光度值；V-樣品提取液總體積；M-樣品的質(zhì)量。

1.3.8 幾丁質(zhì)酶活性測定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測定。取1 g樣品加入3 mL提取緩沖液在冰浴研磨均漿后，離心，取上清酶液待測。

按照幾丁質(zhì)酶試劑盒說明書進行操作，于585 nm下測定樣品吸光度值。幾丁質(zhì)酶活性（U/g組織）計算公式如下：

其中：A-樣品測定吸光度值；M-樣品的質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組樣品平行測定三次，數(shù)據(jù)用x±s來表示。采用SPSS 22.0軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行ANONA顯著性分析，其中p＜0.05代表差異顯著，所有圖表采用Origin 8.0進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻照處理對微生物的影響

不同輻照處理的香菇中含有嗜溫菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量的檢測結(jié)果如表1和表2所示，經(jīng)過不同劑量輻照之后，香菇所含有的嗜溫菌、霉菌和酵母菌數(shù)量顯著減小，而且在貯藏期間，輻照組的嗜溫菌、霉菌和酵母菌數(shù)量顯著低于對照組（p＜0.05），由此可見，輻照能顯著抑制微生物的生長。這與Jiang T[17]研究結(jié)論是一致的，即輻照能抑制微生物生長，但輻照劑量不同，抑菌效果也不同。

表1 不同輻照處理對嗜溫菌數(shù)量的影響Table 1 Effect of different irradiation treatments on mesophilic bacteria

表2 不同輻照處理對霉菌和酵母菌數(shù)量的影響Table 2 Effects of different irradiation treatments on the number of Fungi and Yeast

2.2 不同輻照處理對香菇硬度的影響

消費者判斷香菇品質(zhì)的重要指標(biāo)之一是香菇的硬度[17]，香菇硬度下降是其品質(zhì)劣變的原因之一。

圖1 不同輻照劑量對香菇硬度的影響Fig.1 Effect of different irradiation treatments on the hardness of Lentinus edodes

如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，香菇硬度呈下降趨勢。香菇硬度的下降，可能是采后由于細菌對細胞壁的降解以及內(nèi)源性自溶素的活性增加導(dǎo)致的[21]，在第4 d，香菇硬度差異并不顯著（p＞0.05），不同輻照劑量組硬度下降趨勢大致相同；到貯藏第20 d，4組不同處理的硬度下降率分別是62.18%、41.42%、48.07%和59.97%，0 KGy組和2 KGy組下降較1 KGy組和1.5 KGy組快。1 KGy組的硬度較其他組硬度大，其顯著性p＜0.05，因此，1 KGy輻照處理的香菇硬度較其他組好。Jiang T[17]等人通過實驗得到1.0 KGy和1.5 KGy結(jié)合氣調(diào)包裝可以保持高水平的香菇質(zhì)地達到20 d左右。

2.3 不同輻照處理對香菇色澤的影響

表3 不同輻照處理對香菇色澤的影響Table 3 Effect of different irradiation treatments on the color of Lentinus edodes

表4 不同輻照處理對香菇褐變指數(shù)的影響Table 4 Effect of different irradiation treatments on browning index of Lentinus edodes

香菇在采摘之后，生物體仍在進行活躍的代謝活動，由于貯藏時間的延長，生物體產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物積累導(dǎo)致褐變，組織褐變是評價食用菌品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[22]。香菇組織褐變也有可能歸因于微生物的作用[23]。

由表3和表4可知：到貯藏12 d，香菇色澤差異并不顯著（p＞0.05），說明輻照處理對香菇色澤沒有直接的影響。從貯藏第16 d開始，0 KGy組和1 KGy組香菇變化較 1.5 KGy組和 2 KGy組差異顯著（p＜0.05），到貯藏結(jié)束，1 KGy組的ΔE值為11.12±0.42，較其他組的ΔE值小，表明與理想顏色值相比，香菇色澤變化的程度較??；1 KGy組的褐變指數(shù)為1.21±0.12，相比于其他組的褐變指數(shù)都小，說明1 KGy組的褐變程度較其他組小。

2.4 不同輻照處理對香菇SOD活性和GR活性的影響

圖2 不同輻照處理對香菇SOD活性的影響Fig.2 Effect of different irradiation treatments on SOD activity of Lentinus edodes

圖3 不同輻照處理對香菇GR活性的影響Fig.3 Effect of different irradiation treatments on GR activity of Lentinus edodes

超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽還原酶(GR)是屬于植物抗氧化系統(tǒng)中的酶的，抗氧化系統(tǒng)在植物的成熟和衰老的過程起著重要作用[11]。

由圖2可知：輻照之后的SOD活性呈先升高后降低的趨勢，到貯藏第4 d，香菇的SOD活性差異顯著（p＜0.05），這可能與輻照誘發(fā)自由基的產(chǎn)生有關(guān)[24]。到貯藏第12 d，1 KGy組SOD活性較其他組下降緩慢。由圖3可知：GR活性是呈下降趨勢的，1 KGy組GR活性降低率為49.09%，而0 KGy、1.5 KGy和2.0 KGy組的分別是84.51%、63.63%和76.36%，由此可知1 KGy組 GR活性較其他組下降緩慢，說明劑量為 1 KGy能延緩其抗氧化能力的降低。

2.5 不同輻照處理對香菇PAL活性的影響

PAL是許多植物酚類物質(zhì)和木質(zhì)素等次生物質(zhì)生物合成途徑的關(guān)鍵酶，木質(zhì)素是植物細胞壁次生結(jié)構(gòu)的主要成分，木質(zhì)素含量在貯藏過程中積累會引起植物組織質(zhì)地老化，影響食品的食用口感[25,26]。受到輻照后香菇組織的防衛(wèi)系統(tǒng)特別是苯丙烷代謝被激活，PAL活性迅速上升，提高了組織的抗逆境能力。

圖4 不同輻照處理對香菇PAL活性的影響Fig.4 Effect of different irradiation treatments on PAL activity of Lentinus edodes

由圖可知：PAL活性整體是呈上升趨勢的，說明在貯藏過程中木質(zhì)素的含量是逐漸增加的。輻照第 0 d，1 KGy組與1.5 KGy相比差異并不顯著（p＞0.05），在之后的貯藏期間，對照組與輻照組差異顯著（p＜0.05），說明輻照對PAL活性由影響，由圖可知，貯藏8 d后，1 KGy組明顯呈下降趨勢，說明木質(zhì)素的積累是在逐漸降低的；到貯藏結(jié)束0 KGy、1.0 KGy、1.5 KGy和2.0 KGy組的PAL活性整體上升率分別為57.14%、13.33%、40.01%和25.51%，1 KGy組相比于其他組的PAL活性上升較低，組織質(zhì)地老化較輕，因此，1 KGy輻照能較好的抑制其組織質(zhì)地的老化。

2.6 不同輻照處理對香菇纖維素酶活性的影響

圖5 不同輻照處理對香菇纖維束酶活性的影響Fig.5 Effect of different irradiation treatments on fiber bundle enzyme activity of Lentinus edodes

纖維素是植物細胞壁的主要成分之一，在植物細胞壁中起著重要作用：是衡量細胞老化的指標(biāo)之一[27,28]。纖維素能在纖維素酶的作用下被水解，有實驗結(jié)果表明，香菇貯藏過程中纖維束含量是增加的，香菇中纖維素含量高可能會影響其質(zhì)地老化[11]。

由圖可知：香菇中纖維素酶活性呈上升趨勢，輻照組與對照組差異顯著（p＜0.05），0 KGy、1.0 KGy、1.5 KGy和 2.0 KGy組的纖維素酶活性分別增加了53.12%、67.39%、60.52%和55.88%，1 KGy組活性較其他輻照組強，說明劑量為1 KGy能減少纖維素的積累，較好的保持香菇的質(zhì)地，延遲香菇組織老化。

2.7 不同輻照處理對香菇幾丁質(zhì)酶活性的影響

圖6 不同輻照處理對香菇幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.6 Effect of different irradiation treatments on chitinase activity of Lentinus edodes

幾丁質(zhì)酶能降解幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)是多種真菌細胞壁的主要成分，因此，植物中廣泛存在幾丁質(zhì)酶能抑制病原菌的生長[20]；同時香菇細胞壁中幾丁質(zhì)含量增多與香菇的韌性呈正相關(guān)[21]。由實驗可知，香菇在貯藏期間幾丁質(zhì)的含量是逐漸上升的[11]。由圖可知：在貯藏期間幾丁質(zhì)酶活性是呈下降趨勢的，到貯藏第12 d，輻照組與對照組的差異不顯著（p＞0.05），從貯藏12 d開始，1 KGy組和2 kGy組與其他組相比差異顯著（p＜0.05），1 KGy組的活性高于2 kGy組，說明1 KGy組能較好的抑制微生物的生長；同時能更好的延緩菇體組織的老化。

3 討論

輻照保鮮是一種新型的的保鮮方式，它的原理是通過打破化學(xué)鍵，去除電子形成離子，自由基或ROS，并誘導(dǎo)水分解[29]。Xiong Q等[30]人研究發(fā)現(xiàn)合適劑量的輻照可以抑制雙孢菇開傘和發(fā)生褐變，降低了微生物污染的水平，并且延長了雙孢蘑菇的保質(zhì)期，而對感官特性沒有特別的影響。新鮮蘑菇采后變質(zhì)的速率直接與初始微生物的負荷有關(guān)，伽瑪射線單獨使用或與冷藏結(jié)合已被證明通過減少水分損失、改善顏色和外觀來延長貨架壽命[31]。而高劑量輻照的缺點是破壞細胞分子氧進入細胞質(zhì)，加快了氧化，引起褐變發(fā)生。

針對工廠化生產(chǎn)的大宗香菇來說，輻照保鮮技術(shù)可以實現(xiàn)批量處理，在殺滅有害微生物、控制食源性污染的風(fēng)險的同時，同時不改變香菇的自身的形貌，合適的劑量處理不僅不損耗其營養(yǎng)成分，而且還可以延長其貨架期。其中我們關(guān)注的是輻照處理對香菇自身代謝中酶的應(yīng)激反應(yīng)，因為酶是活體組織中有催化功能的蛋白質(zhì)，可調(diào)節(jié)組織細胞中特定的生化過程，對生物體內(nèi)的代謝起重要調(diào)節(jié)作用。

本研究中的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽還原酶(GR)與香菇酶促抗氧化能力有密切關(guān)系；本研究中的苯丙氨酸解氨酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶與香菇的質(zhì)構(gòu)變化有密切關(guān)系。

其中苯丙氨酸解氨酶與多酚代謝和木質(zhì)素的形成有關(guān)，而纖維素酶和幾丁質(zhì)酶與香菇細胞壁成分的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究中重點關(guān)注輻照處理對香菇貯藏過程中抗氧化相關(guān)酶和質(zhì)構(gòu)相關(guān)酶活的調(diào)控變化規(guī)律，為延緩菇體衰老，保持菇體營養(yǎng)和感官品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)，同時為高品質(zhì)鮮香菇的物流貯藏提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

4.1 香菇在采后容易受到外界環(huán)境和自身酶活等影響而發(fā)生品質(zhì)劣變，因此，采后保鮮的技術(shù)非常重要。輻照保鮮是一種無損的保鮮方式，能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

4.2 通過綜合分析不同輻照劑量對鮮香菇的微生物含量、質(zhì)構(gòu)特性、顏色變化以及相關(guān)酶等活性指標(biāo)的影響可知，相比其他劑量而言，其中1 KGy的輻照劑量結(jié)合低溫貯藏能較好地抑制其品質(zhì)劣變，能延長香菇的貯藏期限達到16～20 d。

4.3 輻照處理能夠有效地抑制采后香菇中的微生物侵染發(fā)生。對香菇輻照的劑量越大，殺菌效果越好，很大的抑制其嗜溫菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量增長，很好的延緩了菇體的腐爛。

4.4 香菇采后發(fā)生環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)，組織內(nèi)活性氧水平提高，導(dǎo)致其氧化產(chǎn)物積累，從而發(fā)生褐變。低劑量的輻照處理能延緩其SOD活性和GR活性的降低。木質(zhì)素、纖維素和幾丁質(zhì)等成分的增加是香菇采后品質(zhì)劣變的主要原因之一。由實驗可知低輻照劑量能延緩PAL活性的增加，抑制纖維素酶活性和幾丁質(zhì)酶活性的降低，達到了抑制其老化的作用。綜合分析相關(guān)酶活性在貯藏過程中的變化可知1 KGy的抑制香菇老化的效果較好。