何世軍,趙光磊,何北海
(華南理工大學輕工科學與工程學院,廣東廣州 510640)
蔗糖成本低廉,來源廣泛,容易獲得,是重要的基礎(chǔ)化工原料之一。蔗糖分子具有高親水性,其結(jié)構(gòu)中含有8個羥基,其中3個為伯羥基,因而具有醇的典型性質(zhì),可與有機酸發(fā)生典型的酯化反應(yīng),生成作為重要精細化工產(chǎn)品的蔗糖酯[1]。而蔗糖酯具有無毒無臭、無刺激及易生物降解等理化性質(zhì);在人體內(nèi)可分解而被機體利用,安全性高[2]。同時大量研究成果表明,特定的蔗糖酯對微生物具有較廣泛的抑制作用,對革蘭氏陽性芽孢桿菌的抑菌作用尤為顯著。如蔗糖癸酸酯對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌具有較強的抗菌作用,抗菌效果與脂肪酸碳鏈長度成反比,且脂肪酸蔗糖雙酯的抗菌作用要優(yōu)于脂肪酸蔗糖單酯;蔗糖八硫酸酯對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌及變形桿菌具有良好的抑制作用;反丁烯二酸蔗糖甲酯對大腸桿菌、蘇云金桿菌、酵母、黑曲霉具有較強的抑制能力,抗菌譜系包括細菌、酵母和霉菌[3~5]。蔗糖酯因在抗菌方面的獨特理化性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化妝品和洗滌劑等生產(chǎn)行業(yè)中。
目前糖酯多采用化學法合成,往往反應(yīng)選擇性差,副產(chǎn)物含量高,且反應(yīng)體系的局部高溫會引起糖焦化,加大糖酯分離提純的難度[6]。而非水相中酶法合成糖酯因其反應(yīng)條件溫和、選擇性高、反應(yīng)產(chǎn)物易分離和溶劑可循環(huán)多次利用,在糖酯合成領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[7]。目前已報道了大量利用酶法催化糖酯合成方法,如在離子液體中利用脂肪酶催化制備棕櫚酸殼寡糖酯,在無水異丙醇中脂肪酶催化合成月桂酸木糖酯,在混合溶劑中利用脂肪酶催化甲基丙烯酸乙烯酯和木糖酯交換反應(yīng)合成木糖酯[8~10]。
研究表明,α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)是體現(xiàn)抗菌活性的有效功能結(jié)構(gòu)[11]。食品工業(yè)中常用的廣譜防腐劑富馬酸和山梨酸具有典型的α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)。但富馬酸和山梨酸在有機溶劑中可游離出質(zhì)子,刺激人體表皮引起過敏。保留α,β-不飽和羰基功能結(jié)構(gòu)的衍生物具有一定程度的抑菌活性,而富馬酸二甲酯和山梨酸甲酯是其代表性的衍生物[12]。但富馬酸甲酯刺激性氣味太重,山梨酸甲酯則易氧化和升華,因而限制了它們在食品、化妝品中的應(yīng)用。為了消除富馬酸、山梨酸及其酯類衍生物的不足,本文研究在蔗糖分子上引入肉桂酸,首次制備了一種保留α,β-不飽和羰基功能結(jié)構(gòu)和同時具有兩親性基團的肉桂酸蔗糖酯。并探討了混合有機溶劑中酶法制備肉桂酸蔗糖酯的方法和產(chǎn)物肉桂酸蔗糖酯的化學結(jié)構(gòu);此外,還進一步研究了產(chǎn)物的抗菌特性、熱穩(wěn)定性和保水性能等。
集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,DF-101S,廣州市星爍儀器有限公司;離心機,TW-3021HR,安徽嘉文儀器裝備有限公司;傅里葉變換紅外光譜儀,TENSOR27,德國 Bruker公司;核磁共振波譜儀,AVANCE III HD 400,德國Bruker公司;UV-Vis光度計,Agilent cary 60,美國Agilent公司;熱重分析儀,STA 449 F3 Jupiter,德國耐馳公司。
肉桂酸,純度>97%,上海阿拉丁試劑有限公司;固定化的脂肪酶(Candida Rugosa Lipase,CRL),700 U/mg,西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;蔗糖、氫氧化鈉、4A分子篩,分析純,上海潤捷化學試劑有限公司;叔戊醇、二甲基乙酰胺(DMAc),分析純,廣州化學試劑廠;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、營養(yǎng)瓊脂,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;白地霉GIM 2.12,廣東微生物菌種保藏中心;大腸桿菌ATCC25922,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
1.2.1 肉桂酸蔗糖酯的制備
將 DMAc與叔戊醇以一定的體積比配制混合有機溶劑并以此作為反應(yīng)溶劑體系。蔗糖與肉桂酸按1:4的摩爾比溶解在DMAc/叔戊醇的混合溶劑中;同時加入脂肪酶和 4A分子篩,脂肪酶用量為蔗糖質(zhì)量的15%;在通入氮氣的恒溫加熱攪拌器中反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,將得到的溶液冷卻,過濾脂肪酶;在5000 r/min、-4 ℃的條件下冷凍離心取出未反應(yīng)的結(jié)晶蔗糖和肉桂酸,并將濾液在60 ℃、20 mBar、60 r/min條件下旋蒸去除溶劑。
1.2.2 取代度測定
皂化滴定法是測定甘油酯皂化值的方法,也是目前測定糖酯取代度(Degree of Substitution,DS)的方法之一。稱取0.2 g肉桂酸蔗糖酯置于錐形瓶中,在20 mL的0.2 mol/L的NaOH和80 mL蒸餾水中溶解,再在75 ℃攪拌2 h進行充分皂化。皂化結(jié)束后加入三滴酚酞,用0.05 mol/L HCl的標準液滴定,以溶液紅色消失為終點。重復滴定三次,取所消耗的HCl標準溶液體積平均值V。同時采用蔗糖原樣做空白對照,記錄滴定消耗HCl標準溶液體積V0。肉桂酸蔗糖酯的取代度計算公式如下:
n=C(V0-V)/1000
DS=342 n/(m-M'*n)
注:342為蔗糖是相對分子質(zhì)量;n為羧基的量(mol);C為所用HCl標準溶液的濃度(mol/L);m為蔗糖酯樣品的質(zhì)量(g);M'為蔗糖被肉桂酸基團取代的增加量(g/mol)。
1.2.3 紅外光譜分析
稱取2 mg肉桂酸蔗糖酯樣品,樣品與溴化鉀按照1/20的質(zhì)量比混合研磨,在80 ℃的烘箱干燥4 h。將研磨均勻的粉末壓片,進行紅外光譜測試。掃描樣品前測量背景通道的背底,排除水和二氧化碳的干擾。每個樣品掃描32次,分辨率為4 cm-1,掃描范圍為4000~400 cm-1。
1.2.4 熱重分析
稱取10 mg肉桂酸蔗糖酯樣品放入坩堝中,升溫程序設(shè)置中溫度范圍從20 ℃到700 ℃,升溫速率為10 ℃/min,保護氣體為氮氣,氮氣流量為25 mL/min。
1.2.5 核磁共振碳譜分析
將旋蒸產(chǎn)物樣品在硅膠板點樣、展開、刮板取樣。取40 mg干燥的刮板樣品溶解在1 mL DMSO-d6中;為了獲得較好的信噪比,設(shè)置如下參數(shù):掃描數(shù),10000;掃描時間,1 h;弛豫時間,2.0 s;接收器增益,187;脈沖寬度,12.0 s;譜寬,36057.7 Hz。
1.2.6 抗菌測試
利用GB/T 20944.3-2008的振蕩法進行肉桂酸蔗糖酯的抗菌性能評價。以肉桂酸蔗糖酯作為抗菌試樣,分別稱取0.25 g,0.50 g,0.75 g;以蔗糖作為對照樣,稱取0.75 g。從3代的保存菌種制成了接種菌懸液。菌懸液經(jīng)過4次稀釋程序后,用來對試樣接種。準備15個250 mL三角燒瓶。在其中3個燒瓶中加入0.75 g蔗糖,3個燒瓶中加0.25 g肉桂酸蔗糖酯,3個燒瓶0.50 g肉桂酸蔗糖酯,3個燒瓶加0.75 g肉桂酸蔗糖酯,另3個燒瓶不加任何試樣,然后在每個燒瓶中各加入70 mL 0.03 mol/L PBS緩沖液。12個燒瓶中各加入1 mL菌懸液,另外不加試樣的3個燒瓶中不加入菌懸液。PBS和菌懸液混勻后,分別吸取1 mL試液移入裝有9 mL、0.03 mol/L PBS緩沖液的試管中,充分混勻,在24 ℃,150 r/min,振蕩18 h。到時間后,用10倍稀釋法進行稀釋。從每個燒瓶中吸取1 mL試液,移入裝有9 mL 0.03 mol/L PBS級沖液的試管中,充分混勻。每個稀釋倍數(shù)的試樣分別吸取1 mL移人無菌的平皿,傾注培養(yǎng)基約15 mL。室溫凝固,倒置平板,37 ℃培養(yǎng)24 h。通過稀釋的方法測定振蕩前及振蕩24 h后的活菌濃度,計算抑菌率,以此評價試樣的抗菌效果。
1.2.7 保水性能分析
參考GB 5009.3-2010食品中水分測定的第二法,測定肉桂酸蔗糖酯和蔗糖的含水量,以此評價其保水性能。將樣品研磨成粒徑小于2 mm的粉末,稱取0.5 g樣品置于80 ℃干燥箱中,恒溫加熱4.0 h。取出樣品,置干燥器內(nèi)冷卻至室溫稱量,并重復干燥至前后兩次質(zhì)量差不超過2 mg。
2.1.1 混合溶劑的體積比對肉桂酸蔗糖酯合成反應(yīng)的影響研究
圖1 不同體積比的混合溶劑對肉桂酸蔗糖酯取代度的影響Fig.1 Effect on mixed solvents with different volume ratio to DS
溶劑的極性對酶法制備蔗糖酯的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率具有重要影響[13]。DMAc毒性較小和對蔗糖溶解度較大,因而工業(yè)上一般使用親水性的 DMAc作為生產(chǎn)蔗糖酯的溶劑,但是DMAc的極性較大而易使酶活降低。通過在溶劑 DMAc中混和適當比例的弱極性溶劑叔戊醇,可使酶保持較高活性,從而提升蔗糖酯的轉(zhuǎn)化率。此外,叔戊醇是常用的常壓下沸點為103 ℃的弱極性溶劑,通過旋蒸的方法可輕易去除,對蔗糖酯的分離提純有利。通過研究混合溶劑比例對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響,可提高蔗糖酯的合成效率。圖1展示了DMAc與叔戊醇在不同體積比時,對蔗糖取代度的影響。當叔戊醇的體積比從0增加到25%時,肉桂酸蔗糖酯的取代度從 0.38±0.02不斷增加 0.71±0.02,增幅為86.84%,并達到最大;主要因為叔戊醇平衡了強極性溶劑 DMAc對酶分子活性的影響從而維持酶相對完整的空間構(gòu)象[14]。當叔戊醇體積比由25%提升至45%時,肉桂酸蔗糖酯的取代度出現(xiàn)下降,取代度從0.71±0.02不斷降低0.41±0.02,降幅為42.25%;主要是因為疏水性溶劑的增加降低了反應(yīng)底物的溶解度,同時酶活性中心部位會形成水分子團簇而包圍酶分子,增加傳質(zhì)阻力,引起酶分子的結(jié)構(gòu)變形,使得酶活降低[13]。綜合研究結(jié)果表明,混合溶劑的極性對蔗糖酯合成具有顯著影響;同時說明溶劑體系中引入弱極性溶劑之后,可較好地溶解極性底物蔗糖,同時保持脂肪酶的良好活性。
2.1.2 溫度對肉桂酸蔗糖酯合成反應(yīng)的影響研究
圖2 溫度對肉桂酸蔗糖酯取代度的影響Fig.2 Effect of temperature on the DS of enzymatic reaction
反應(yīng)溫度是影響酶催化反應(yīng)最顯著的因素之一,直接關(guān)系著催化反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率。如圖2所示,反應(yīng)溫度從40 ℃逐步升高到50 ℃時,反應(yīng)產(chǎn)物的取代度從0.45±0.02增加到0.73±0.02,并達到最大值,增幅62.22%。主要是因為反應(yīng)溫度升高可以使底物分子的運動加快,提高有效碰撞幾率,從而提高酶與底物的催化效率。但是隨著反應(yīng)溫度從50 ℃升高到60 ℃時,反應(yīng)產(chǎn)物的取代度開始出現(xiàn)下降,從 0.73±0.02降低到0.06±0.02。反應(yīng)產(chǎn)物的取代度開始降低,主要是因為溫度過高使酶蛋白中心構(gòu)象轉(zhuǎn)變而降低酶活。在60 ℃的反應(yīng)溫度時,脂肪酶仍具有一定的酶活,反應(yīng)產(chǎn)物的取代度為0.39±0.02,說明說明固定化的脂肪酶能夠耐受較高的反應(yīng)溫度,提升了脂肪酶在反應(yīng)體系的熱穩(wěn)定性,表現(xiàn)出一定的催化活性。綜合研究結(jié)果表明,反應(yīng)體系的溫度主要受到脂肪酶的耐受溫度限制,反應(yīng)溫度偏高或偏低,對反應(yīng)產(chǎn)物的取代度都不利;同時脂肪酶法合成肉桂酸蔗糖酯的最適溫度為50 ℃,與化學法相比反應(yīng)條件非常溫和。
圖3 反應(yīng)產(chǎn)物紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of the reaction product
紅外譜圖的吸收峰強度與峰形是由化合物不同基團互相作用的結(jié)果,不同基團的特征吸收峰,其峰位置、峰形和峰強也不同。蔗糖的主要特征吸收峰來自5個仲醇羥基和3個伯醇羥基,而蔗糖被酯化后利用紅外光譜可快速分析糖酯產(chǎn)物的酯基特征結(jié)構(gòu)。如圖3所示,樣品a作為空白對照,反應(yīng)過程中沒有使用脂肪酶,其它試驗條件與樣品b、樣品c完全相同。樣品a、b、c的紅外譜圖在3401 cm-1處有個寬而強的吸收峰,歸屬于產(chǎn)物中的羥基(-OH)伸縮振動峰。由于蔗糖是具有8個羥基,分子間可形成締合氫鍵,該吸收峰的波數(shù)向低頻移動,從而在此處形成寬大波形峰。2937 cm-1及1635 cm-1分別為產(chǎn)物中亞甲基的C-H伸縮振動峰和H-O-H彎曲振動峰。一般而言,羧基的伸縮振動峰出現(xiàn)在1770~1750 cm-1,酯基的伸縮振動峰出現(xiàn)在1750~1725 cm-1;從圖3中觀察可知,1731 cm-1處的吸收峰是酯基υ(C=O)特征峰[15]。綜合研究表明,酯化產(chǎn)物b、c在1731 cm-1都出現(xiàn)新特征吸收峰,而樣品a未出現(xiàn)該特征吸收峰,說明在脂肪酶的作用下肉桂酸與蔗糖發(fā)生了酯化反應(yīng);并且隨著取代度的增大,1731 cm-1處的吸收峰增強。
表1 蔗糖、肉桂酸及肉桂酸蔗糖酯的13C-NMR化學位移Table 1 13C-NMR chemical shifts of sucrose, cinnamic acid and cinnamate sucrose ester
為了進一步明確肉桂酸蔗糖酯的化學結(jié)構(gòu)及?;稽c,利用13C-NMR對其進行結(jié)構(gòu)鑒定。核磁共振技術(shù)可提供分子中碳原子的類型、周圍化學環(huán)境的結(jié)構(gòu)信息,該方法可分析肉桂酸蔗糖酯的化學結(jié)構(gòu)。Michel[16,17]等利用13C-NMR技術(shù)對糖類化合物及其?;a(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)分析并總結(jié)了可用于鑒定糖類酰化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的解析方法。該方法認為當糖類化合物的某一羥基發(fā)生酰化反應(yīng)后,與該羥基直接相連碳原子信號峰的化學位移會向低場移動,而相鄰碳原子信號峰的化學位移則會向高場移動。由表1的13C NMR譜數(shù)據(jù)所示,肉桂酸基團的 C-9由 168.00×10-6偏移至170.20×10-6,向低場偏移了2.20×10-6,說明肉桂酸與蔗糖發(fā)生了酯化反應(yīng)。蔗糖基團 C-5信號峰由73.36×10-6偏移至70.80×10-6,向高場偏移了2.56×10-6;蔗糖基團C-6信號峰由61.00×10-6偏移至63.48×10-6,向低場偏移了2.48×10-6。綜合分析,可以判斷脂肪酶促酯化反應(yīng)發(fā)生在蔗糖的C-6位點,同時說明脂肪酶對肉桂酸蔗糖酯的合成催化具有區(qū)域選擇性。根據(jù)產(chǎn)物結(jié)構(gòu),確定脂肪酶催化肉桂酸蔗糖酯的合成反應(yīng)式如圖4所示:
圖4 肉桂酸蔗糖酯合成反應(yīng)式Fig.4 Reaction scheme of cinnamate sucrose estersynthesis
圖5 肉桂酸蔗糖酯的DTG曲線Fig.5 DTG curves of cinnamate sucrose ester
食品工業(yè)中為了降低加工黏度或提升滅菌效率,常需要高溫處理,從而提升生產(chǎn)效率。然而為了防止爆炸保證安全生產(chǎn),或為了防止物料分解產(chǎn)生副反應(yīng),在食品的加工和滅菌過程要求物料性質(zhì)保持穩(wěn)定[18]。研究肉桂酸蔗糖酯的熱穩(wěn)定性非常必要。在氮氣環(huán)境下進行熱重分析,在升溫程序中只有揮發(fā)、解聚、分解,可以反映肉桂酸蔗糖酯的熱穩(wěn)定性。由圖5可知,曲線 a表明蔗糖樣品的初始降解溫度為 196 ℃,在224 ℃達到最大失重速率,說明蔗糖只對應(yīng)著一個分解溫度,主要過程是糖苷鍵的斷裂。曲線b和曲線c表明肉桂酸蔗糖酯的初始降解溫度為215 ℃,同時具有兩個分解溫度;在228 ℃的失重峰代表蔗糖糖苷鍵斷裂的溫度,在274 ℃的失重峰代表肉桂酸蔗糖酯的酯鍵斷裂溫度。曲線b和曲線c在115 ℃出現(xiàn)失重峰,主要由于肉桂酸蔗糖酯通過氫鍵吸附的水分揮發(fā)引起。研究發(fā)現(xiàn),蔗糖酯化后,酯化產(chǎn)物肉桂酸蔗糖酯的熱穩(wěn)定性提升,其初始降解溫度提高了19 ℃,可能與產(chǎn)物的平均分子相對質(zhì)量提高有關(guān)。肉桂酸蔗糖酯可以承受高于220 ℃的高溫而不分解,遠高于食品中許多物料的加工溫度,可在食品工業(yè)的熱加工中保持穩(wěn)定。
肉桂酸蔗糖酯與食品工業(yè)中常用的防腐劑山梨酸都具有α、β不飽和羰基功能結(jié)構(gòu),具有較好的抗菌活性。而大腸桿菌是日常生活中常見細菌類病原菌,白地霉是食品中常見的真菌類腐敗菌,研究肉桂酸蔗糖酯對大腸桿菌和白地霉的抗菌性能具有重要意義。從圖6~8的觀察可知,肉桂酸蔗糖酯的抗菌性能隨著肉桂酸蔗糖酯量的增加,抑菌率不斷增加。而肉桂酸蔗糖酯對大腸桿菌的最大抑菌率為97.83%,對白地霉的最大抑菌率為96.04%。這是由于微生物吸收肉桂酸蔗糖酯的同時,具有共軛基團連接的羧基碳正離子易與胞膜上帶負電的蛋白質(zhì)、類脂化合物相互吸附,導致細胞變形[19,20];同時被吸收的肉桂酸基團會阻礙菌體生物催化酶和蛋白質(zhì)的合成;當肉桂酸蔗糖酯被微生物吸收時,羧基會與氨基酸分子中的琉基、羥基、亞氨基等基團作用發(fā)生縮合反應(yīng),這些具有供體性質(zhì)的氨基酸殘基常位于酶的催化域和結(jié)構(gòu)域中,對維持酶類的活性及穩(wěn)定性具有十分重要的作用[21]。研究結(jié)果表明,肉桂酸蔗糖酯對大腸桿菌和白地霉具有明顯的抑制作用。肉桂酸蔗糖酯與其它保留α,β-不飽和羰基功能基團化合物的防腐抑菌機理一致[11,12]。
圖6 肉桂酸蔗糖酯對大腸桿菌的抗菌測試Fig.6 Antimicrobial test of cinnamate sucrose ester againstEscherichia coli
圖7 肉桂酸蔗糖酯對白地霉的抗菌測試Fig.7 Antimicrobial test of cinnamate sucrose ester againstGeotrichum candidum
圖8 肉桂酸蔗糖酯對大腸桿菌和白地霉的抑菌率Fig.8 Inhibition rates of cinnamate sucrose ester to Escherichia coli and Geotrichum candidum
2.6 肉桂酸蔗糖酯的保水性能研究
圖9 蔗糖、肉桂酸蔗糖酯和丙三醇的保水率Fig.9 Comparison of water retention rates of sucrose,cinnamate sucrose ester and glycerol
水分是食品加工及貯藏過程中一項關(guān)鍵的質(zhì)構(gòu)參數(shù),也是影響淀粉類食品老化因素之一;水分降低會使得食品變得堅韌并出現(xiàn)皺褶,喪失其柔軟性,同時保持適量的水分可阻止某些組分結(jié)晶而變硬。圖9顯示,蔗糖、肉桂酸蔗糖酯和丙三醇的保水率分別為88%,76%和148%。與蔗糖相比,肉桂酸蔗糖酯的保水率下降了 8%,但仍具有良好的保水性能,肉桂酸蔗糖酯的保水性能來源于蔗糖分子中為被取代的羥基。此外,雖然肉桂酸蔗糖酯的保水率不及丙三醇,但肉桂酸蔗糖酯分子內(nèi)具有裂褶結(jié)構(gòu)有利于長時間保持水分,而丙三醇相對分子質(zhì)量較小,吸附的水分易流失,持久性不良。研究結(jié)果表明,肉桂酸蔗糖酯在持久長效保水方面具有明顯的優(yōu)勢,其良好的保水性能使其功能不限于食品的保水和抗菌,在保水補水的化妝品領(lǐng)域也具有廣闊應(yīng)用前景,發(fā)揮防腐和長效保濕的作用。
3.1 酯化產(chǎn)物的紅外光譜結(jié)果表明,在 DMAc/叔戊醇溶劑體系中脂肪酶催化下,蔗糖與肉桂酸發(fā)生了酯化反應(yīng),酯化產(chǎn)物在 1731 cm-1出現(xiàn)了酯基伸縮振動峰。
3.2 酯化產(chǎn)物的核磁共振碳譜結(jié)果表明,酯化反應(yīng)發(fā)生在蔗糖的C6位點上。
3.3 酯化產(chǎn)物的熱重分析結(jié)果表明,肉桂酸蔗糖酯的熱穩(wěn)定性提升,初始降解溫度提高了19 ℃。
3.4 肉桂酸蔗糖酯對大腸桿菌的最大抑菌率為97.83%,對白地霉的最大抑菌率達到為96.04%。說明蔗糖與肉桂酸酯化后,賦予了肉桂酸蔗糖酯良好的抗菌性能。
3.5 肉桂酸蔗糖酯的保水保濕效果良好,保水率達到76%。說明肉桂酸蔗糖酯未被酯化的羥基保留了蔗糖良好的親水性。