張立秋，陳玲，崔艷艷，沈明浩

（1.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，吉林通化 134000）（2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

目前我國糖尿病人群已居世界糖尿病大國之首[1]，2010年流行病學(xué)調(diào)查研究表明：中國成人的患病率為11.6%[2]。胰島素分泌不足、胰島素釋放延遲和周圍組織胰島素作用損害都是造成糖尿病的原因。研究表明糖尿病與先天遺傳、自身營養(yǎng)代謝異常、外界環(huán)境、暴飲暴食和病毒感染等有關(guān)[3]。當(dāng)前，市場上最為常見的治療糖尿病的傳統(tǒng)藥物-胰島素及其類似物制劑仍主要為注射劑，這種注射給藥方式，不僅病人受罪并且易產(chǎn)生藥物依賴[4]。因此對降血糖藥物的研究越來越受到重視，其中從天然藥物尤其是中藥中尋找降血糖的有效成分是一條重要途徑。近年來，從中藥植物中發(fā)現(xiàn)的天然降血糖活性成分主要包括多糖類、皂苷類、生物堿類、黃酮類、萜類及多肽和氨基酸類等。

東風(fēng)菜(Doellingeria scaber(Thunb.) Nees)，別名大耳毛、盤龍草、山白菜、貓滑尖、毛鏵尖等，為菊科草本植物，有地下莖[5]。黃酮類物質(zhì)是一種多酚代謝物。其分子的結(jié)構(gòu)類型是以C6-C3-C6為碳鏈構(gòu)成一類化合物[6]，其分子量相對較小。根據(jù)數(shù)據(jù)表明，全球目前已經(jīng)成功得到4000種左右的這類物質(zhì)[7]。綠色植物也通過自身的光合作用將百分之二左右的碳轉(zhuǎn)化為黃酮類物質(zhì)[8]。黃酮化合物通常狀態(tài)下呈黃色或淡黃色結(jié)晶粉末，少數(shù)為非結(jié)晶無定形粉末[9]，難溶于水，易溶于有機溶劑。黃酮類化合物有廣泛的生理活性而且毒性小。研究表明：黃酮類物質(zhì)可以夠抗自由基，預(yù)防癌癥，促使腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[10]。在預(yù)防糖尿病和腎病方面也表現(xiàn)出良好的效果[11]。在抗菌、抗病毒[12]、提高免疫[13]、護肝和降脂等方面均有良好的治療效果。因此，藥食同源植物中分離純度高、活性強的黃酮類化合物在醫(yī)療保健方面有重要作用。

目前綠色天然食物倍受人們所青睞，像東風(fēng)菜這種富含多種功效成分及營養(yǎng)物質(zhì)的野生資源無疑會成為研究的熱點。我國吉林地區(qū)東風(fēng)菜資源豐富，東風(fēng)菜既是爽口的野菜[14]又能提高免疫力，使人健康長壽，而且有清熱解毒、祛風(fēng)止痛的功效。用于治療蛇毒、腸炎、傷寒、咽喉炎、關(guān)節(jié)炎，外用治創(chuàng)傷[15]。眾多研究表明綠色植物中的黃酮、皂苷和多糖都具有降低血糖，抗氧化，調(diào)節(jié)血脂，提高免疫的作用。所以我們推測東風(fēng)菜中的黃酮類物質(zhì)也具有降血糖血脂和抗氧化作用。由此設(shè)想入手，本文對東風(fēng)菜中總黃酮進(jìn)行提取優(yōu)化，并對其降血糖、降血脂及抗氧化作用研究，以期能為東風(fēng)菜資源的開發(fā)利用提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生東風(fēng)菜，采自長春科技學(xué)院學(xué)院種植園；昆明種小白鼠（SCXK-（吉）2003-0001），吉林大學(xué)實驗動物中心提供；羧甲基纖維素鈉（食品級），上海析明生物科技有限公司；蘆丁對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），天津一方科技有限公司；無水乙醇、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙酸乙酯均為分析純，生產(chǎn)廠家北京化工；AB-8大孔吸附樹脂購自東鴻化工有限公司；低密度脂蛋白（LDL-C）測試盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、甘油三酯(TG)測試盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、高密度脂蛋白（HDL-C）測試盒、葡萄糖（Glu）檢測試劑盒均購自天根生物科技。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY-220電子天平，島津國際貿(mào)易有限公司；索氏提取器，實驗室組裝；KQ-250B型超聲波清洗器，東京理化器械株式會社；RE52-ASDFGHJ98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器公司；SP-722E型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；水流抽氣機A-1000S，日本EYELA；恒流泵，廣州滬瑞明儀器公司；WD-2102型自動酶標(biāo)儀，北京市六一儀器廠；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 東風(fēng)菜總黃酮樣品的制備

1.3.1.1 東風(fēng)菜總黃酮的提取

將采摘后的東風(fēng)菜進(jìn)行自然風(fēng)干，去其根部，用超微粉碎機將其粉碎成粉，過40目篩。精確稱取一定量東風(fēng)菜干燥粉末用濾紙包好，放入回流裝置中，用一定量的石油醚進(jìn)行回流脫脂。將脫脂后的東風(fēng)菜干粉放在燒杯中，加入一定濃度的乙醇溶液數(shù)毫升，用玻璃棒攪拌均勻，用保鮮膜封住燒杯口，放入超聲清洗機中，調(diào)節(jié)提取溫度、功率和時間進(jìn)行超聲提取。提取結(jié)束后，分離濾渣和濾液，在濾渣中繼續(xù)加入同樣濃度的乙醇溶液重復(fù)操作，合并提取液，進(jìn)行抽濾去除廢渣，收集提取液。向濾液中加入一定量的活性炭粉末進(jìn)行脫色，離心除去活性炭，將濾液進(jìn)行旋蒸，用濃度為80%的乙醇溶液溶出進(jìn)行醇沉，4 ℃保存過夜。然后用體積比為1：1的正丁醇水飽和溶液進(jìn)行萃取，操作兩次，將萃取液旋蒸至浸膏狀，冷凍干燥制得東風(fēng)菜總黃酮粗品。

1.3.1.2 東風(fēng)菜總黃酮的純化

將按照1.3.1.1提取的東風(fēng)菜總黃酮，參照敬思群[16]的昆侖雪菊總黃酮最優(yōu)純化的條件，采用AB-8大孔吸附樹脂純化提取出來的東風(fēng)菜總黃酮，純化條件為：上樣液濃度1.04 mg/mL、pH=4、上樣流速3 BV/h，用5 BV的70%乙醇以2 BV/h流速洗脫。純化后計總黃酮的含量（p），公式如下。

式中：X為反應(yīng)樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為反應(yīng)體系的體積（mL）；N為定容的體積與反應(yīng)樣液之比；m為總黃酮質(zhì)量（mg）。

1.3.2 東風(fēng)菜總黃酮對四氧嘧啶小鼠降血糖血脂及抗氧化作用研究

1.3.2.1 糖尿病小鼠模型動物分組及造模

取18～22 g的健康雌性昆明小鼠60只，將小鼠放入動物室內(nèi)喂飼基礎(chǔ)飼料，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度控制在18 ℃～22 ℃、濕度控制在51%～61%、合理照明。期間小鼠自由攝食飲水，觀察7 d。采用隨機法將實驗動物分成6組，分別為二甲雙胍組、空白組、模型組、總黃酮溶液低、中、高劑量組，每組10只，禁食24 h，模型組一次性腹腔注射四氧嘧啶200 mg/kg[17]，正常組給予生理鹽水。72 h后，眼眶后靜脈叢取血，分離血清，測小鼠空腹血糖值，取血糖值≥11.1 mmol/L的作為糖尿病模型。陽性對照組按照小鼠的體重灌胃劑量為25 mg/kg的二甲雙胍溶液，空白組和模型組用蒸餾水進(jìn)行灌胃，總黃酮組按高、中、低灌胃劑量分別為200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg，根據(jù)小鼠的體重灌胃體積都為0.1 mL/10 g，一日一次，每天記錄小鼠的飲水量、進(jìn)食量及體重變化，試驗周期為28 d。

1.3.2.2 組織樣品的制備

血清液制備：試驗小鼠在最后一次灌胃結(jié)束后，斷食1 d。試驗開始前稱量小鼠體重并記錄，對每只小鼠進(jìn)行尾靜脈取血測定空腹血糖值，根據(jù)小鼠體重灌胃葡萄糖，灌胃劑量為2.0 g/kg bw，測定灌胃后0、30、120 min的血糖值。操作結(jié)束后用鑷子摘取眼球采血入離心管，3500 r/min 4 ℃離心10 min，吸取上層血清，存放4 ℃冰箱中臨時保存待檢測。

肝組織液制備：立即解剖小鼠，快速取出肝組織0.2～1.0 g，放入勻漿器進(jìn)行勻漿，添加9倍質(zhì)量的預(yù)冷的生理鹽水稀釋十倍的組織勻漿液（10%），同理分別制1%和0.25%的組織勻漿液備用。

1.4 數(shù)據(jù)分析

動物試驗所有試驗數(shù)據(jù)均采用PASW Statistics18軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以±s表示；顯著性分析為單向方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 東風(fēng)菜總黃酮純化結(jié)果

采用AB-8吸附樹脂純化后的東風(fēng)菜總黃酮含量達(dá)到50.59%。

2.2 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠的降血糖作用研究

2.2.1 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠空腹血糖值影響

造模前及給藥28 d后小鼠空腹血糖值測定值見表1。和空白組比較，注射四氧嘧啶后，試驗動物的血糖顯著升高，表明造模成功。與模型對照組相比，東風(fēng)菜總黃酮各劑量組及陽性二甲雙胍對照組均能降低糖尿病小鼠的血糖值，其中陽性二甲雙胍對照組、東風(fēng)菜總黃酮低試驗結(jié)果達(dá)差異顯著水平，東風(fēng)菜總黃酮高、中劑量組達(dá)差異極顯著水平。說明東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病模型小鼠具有降低血糖的作用，而且這種降糖作用以高劑量效果最佳。

表1 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠空腹血糖值的影響Table 1 Effects of the components of Doellingeria scaber on fasting blood glucose in four alloxan diabetic mice(±s, n=10)

表1 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠空腹血糖值的影響Table 1 Effects of the components of Doellingeria scaber on fasting blood glucose in four alloxan diabetic mice(±s, n=10)

注：a.與空白對照組相比，p＜0.01；b.與空白對照組相比p＜0.05；c.與模型對照組相比，p＜0.05；d.與模型對照組相比p＜0.01；e.與二甲雙胍組相比p＜0.05；f.與二甲雙胍組相比p＜0.01。

組別 組別劑量/(mg/kg·bw) 試驗前血糖/(mmol/L) 試驗后血糖/(mmol/L)空白對照組 / 4.80±0.538 5.95±1.278模型對照組 / 22.4±4.236a 22.68±2.194二甲雙胍對照組 25 21.5±3.215a 6.61±1.369d總黃酮低劑量組 50 21.1±2.381a 20.56±2.878f總黃酮中劑量組 100 21.7±4.225a 14.52±1.461ec總黃酮高劑量組 200 23.1±3.234a 8.98±1.79 d

2.2.2 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠糖耐量影響

東風(fēng)菜總黃酮對小鼠糖耐量試驗結(jié)果見表 2。試驗結(jié)果顯示，所有的試驗動物灌胃葡萄糖30 min后血糖值都達(dá)到最高水平。空白對照組血糖值隨后開始逐漸恢復(fù)，120 min時恢復(fù)到正常血糖范圍，而模型對照組小鼠血糖值一直偏高，出現(xiàn)出糖耐受量下降的現(xiàn)象，表明造模成功。

陽性對照組、東風(fēng)菜總黃酮各量組小鼠血糖值在30 min時達(dá)到最高水平，但隨后逐漸降低，120 min時恢復(fù)到接受糖負(fù)荷前水平。與模型組小鼠血糖值相比二甲雙胍組、東風(fēng)菜總黃酮中、高劑量組達(dá)差異極顯著水平。

表2 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠糖耐量影響Table 2 Effect of functional components of Doellingeria scaber on glucose tolerance in four diabetic mice (±s, n=10)

表2 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠糖耐量影響Table 2 Effect of functional components of Doellingeria scaber on glucose tolerance in four diabetic mice (±s, n=10)

注：同表1。

組別 0/min 30/min 120/min空白對照組 4.2±0.55 6.56±1.01 3.24±0.61模型對照組 28.05±1.35 a 27.61±1.13 a 26.01±0.86 a二甲雙胍對照組 15.69±2.54 ad 28.5±1.96 a 17.15±1.09 ad總黃酮低劑量組 20.02±1.32 a 25.02±2.28 a 22.48±1.65 a總黃酮中劑量組 18.83±1.71 ac 27.58±1.23 a 18.79±1.10 ad總黃酮高劑量組 17.17±1.03ad 23.44±1.61a 17.98±1.37 ad

2.2.3 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠體重影響

表3表明，在注射四氧嘧啶造模后，經(jīng)過每天對小鼠的觀察及稱量，可以明顯的發(fā)現(xiàn)建模后的小鼠和正常小鼠相比體重日益減小，進(jìn)食量、飲水量也隨之增加，排尿量加大，墊料每天換兩次，小鼠皮毛明顯變松且灰暗無光澤，表現(xiàn)出明顯的“三多一少”癥狀。而在給藥28 d結(jié)束后，各劑量小鼠體重雖有所增加，但與正常對照組相比仍然具有明顯的不同。把各試驗組小鼠的體重和模型對比較，總黃酮高劑量組小鼠體重差異顯著，體重回升較為明顯。

表3 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠體重影響Table 3 Effects of the components of Doellingeria scaber on the weight of four alloxan diabetic mice

2.2.4 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠每日進(jìn)食量影響

圖1 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠每日進(jìn)食量影響Fig.1 Effects of Doellingeria scaber on daily intake of four alloxan diabetic mice

東風(fēng)菜總黃酮對四氧嘧啶糖尿病小鼠進(jìn)食量影響結(jié)果見圖 1。結(jié)果表明，糖尿病小鼠日進(jìn)食量明顯加大，在喂養(yǎng)期間，糖尿病模型小鼠一直呈現(xiàn)多食的情況，且表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，給予東風(fēng)菜總黃酮后，各劑量組小鼠日進(jìn)食量隨著給藥時間的延長有逐漸減少的趨勢，各組效果差異不大。

2.2.5 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠每日飲水量影響

圖2 東風(fēng)菜在總黃酮對糖尿病實驗動物每日飲水量影響Fig.2 Effects of Doellingeria scaber on the daily water consumption of four alloxan diabetic mice

由圖2可知，糖尿病小鼠的每日進(jìn)水量明顯變大，其中模型對照組試驗動物的每日進(jìn)水最多并且持續(xù)增加，陽性對照組及東風(fēng)菜總黃酮各劑量組小鼠的日飲水量低于模型對照組，隨著給藥時間的延長，東風(fēng)菜總黃酮各劑量組小鼠的日飲水量呈降低的趨勢，其中東風(fēng)菜總黃酮高劑量組效果較好。

2.3 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠降血脂作用研究

東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠降血脂作用測定見表4。與正常對照組小鼠相比較，糖尿病模型組小鼠TG、TC和 LDL-C明顯高于正常對照組(p＜0.01)，HDL-C含量明顯降低，表明建模成功。給予二甲雙胍后，TG、TC和LDL-C均有顯著降低(p＜0.05或p＜0.01)，HDL-C含量明顯升高，表現(xiàn)出良好的治療效果。與模型組TC值相比，總黃酮中、高劑量組表現(xiàn)為差異極顯著，總黃酮低劑量組差異性顯著；與模型組TG值相比，總黃酮高劑量組表現(xiàn)為差異極顯著；與模型組 HDL-C值相比，東風(fēng)菜總黃酮高劑量組差異顯著，東風(fēng)菜總黃酮低、中劑量組差異極顯著；與模型組LDL-C值相比東風(fēng)菜總黃酮各試驗組 LDL-C值均表現(xiàn)出顯著性差異(p＜0.05 或p＜0.01)。

其中最佳試驗組較模型組的 TC值降低了27.38%，TG降低了18.71%，HDL-C值提高了44.55%，LDL-C值降低了24.81%。

表4 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量的影響Table 4 Effects of Doellingeria scaber on serum levels of TC, TG, HDL-C and LDL-C in four alloxan diabetic mice

2.4 東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠抗氧化作用研究

東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病試驗動物肝組織中 MDA含量、SOD活力測定結(jié)果見表5。由表所示，與空白對照組相比較，模型組小鼠肝組織中MDA的含量明顯升高，SOD的活性明顯下降，都表現(xiàn)為極顯著性差異。與模型對照組MDA值相比東風(fēng)菜總黃酮中、低劑量組表現(xiàn)出差異顯著水平。

與模型組SOD值相比，二甲雙胍組差異極顯著，東風(fēng)菜總黃酮各劑量組 SOD活性差異顯著。其中最佳試驗組較模型組的MDA值降低18.79%，SOD值提高了15.40%。

表5 東風(fēng)菜總黃酮小鼠肝臟中MDA含量、SOD活力的作用Table 5 Effects of Doellingeria scaber on MDA content and SOD activity in liver of four alloxan diabetic mice

東風(fēng)菜總黃酮對糖尿病小鼠肝臟 CAT活力、GSH-Px活力測定結(jié)果見表6。由表所示，與空白對照組相比較，模型組小鼠CAT、GSH-Px值都明顯的降低，表現(xiàn)出極顯著的差異性。與模型組CAT值相比，東風(fēng)菜總黃高劑量組差異極顯著，二甲雙胍對照組、東風(fēng)菜總黃酮中、低劑量組差異顯著。

與模型組GSH-Px值相比，陽性二甲雙胍對照組、東風(fēng)菜總黃酮中劑量組差異極顯著。其中最佳試驗組較模型組的CAT值提高了47.84%，GSH-Px值提高了41.02%。

表6 東風(fēng)菜總黃酮中小鼠肝臟GSH-Px含量、CAT活力的作用Table 6 Effects of Doellingeria scaber on GSH-Px content and CAT activity in liver of four alloxan diabetic mice

3 討論

近年來糖尿病備受人們關(guān)注。很多糖尿病患者臨床表現(xiàn)為代謝紊亂，體內(nèi)血糖血脂水平及氧化應(yīng)激的異常改變，胰島素抵抗降低，使糖尿病患者飽受煎熬[18～20]。本實驗通過對小鼠腹腔注射四氧嘧啶構(gòu)建糖尿病模型，從東風(fēng)菜中提取總黃酮對小鼠進(jìn)行灌胃，檢測其降血糖作用。在以東風(fēng)菜總黃酮為試驗組對糖尿病小鼠降血糖試驗中，東風(fēng)菜總黃酮能降低其空腹血糖值（Glu），改善糖耐量，并有效緩解其“三多一少”癥狀，其中總黃酮高劑量組降糖效果與陽性組作用效果相當(dāng)。

糖尿病是因為人體的胰島素不足引起血糖值升高的疾病，胰島素不僅調(diào)節(jié)著血糖的濃度變化，還同樣是脂肪和蛋白質(zhì)代謝的主要控制因素[21]。糖尿病患者往往伴隨著高血脂癥狀的困擾[22]。通過對比研究東風(fēng)菜總黃酮對尿病小鼠的降血脂作用的影響，試驗結(jié)果顯示東風(fēng)菜總黃酮能夠降低試驗性糖尿病小鼠血清TC、TG和HDL-C的濃度，提高低密度脂蛋白LDL-C的濃度，表明東風(fēng)菜總黃酮有良好的降血脂作用，能夠有效的調(diào)節(jié)血脂代謝，進(jìn)而實現(xiàn)其降血糖作用。

有研究表明，“氧化應(yīng)激”是糖尿病的主要原因之一，人們可以增強機體抗氧化能力緩解糖尿病帶來的痛苦[23]。丙二醛（MDA）是機體受到氧化自由基攻擊時形成的脂質(zhì)環(huán)內(nèi)過氧化物，其對細(xì)胞具有很大的毒性[24]。測試丙二醛的量可以反映機體的氧化程度，進(jìn)而間接地反映出細(xì)胞的損傷情況[25]。通過對比研究東風(fēng)菜總黃酮對尿病小鼠的抗氧化作用的影響，該試驗結(jié)果顯示東風(fēng)菜總黃酮各劑量組能不同程度的減小糖尿病小鼠肝組織中MDA的濃度，其中總黃酮中高劑量組作用效果最佳。表明東風(fēng)菜總黃酮可以減少脂質(zhì)過氧化物MDA的形成，增強機體的抗氧化能力。

肝臟是人體的代謝器官，代謝過程中有很多酶的參與。GSH-Px、SOD、CAT使肌體內(nèi)防御系統(tǒng)酶類，能夠清除機體內(nèi)的氧化自由基，保持機體氧化代謝的平衡[26]。因此本試驗糖尿病小鼠肝組織內(nèi)以上三種酶進(jìn)行檢測，通過對比研究東風(fēng)菜總黃酮對尿病小鼠的抗氧化作用的影響。實驗結(jié)果表明：東風(fēng)菜總黃酮能提高小鼠體內(nèi)三種酶的含量在試驗過程中發(fā)現(xiàn)個別實驗組中劑量組作用效果優(yōu)于高劑量組，分析原因可能是灌胃濃度過高時對機體產(chǎn)生了毒副作用，作用效果反而下降。

4 結(jié)論

東風(fēng)菜總黃酮降糖降脂抗氧化試驗表明，東風(fēng)菜總黃酮能夠明顯降低糖尿病小鼠空腹血糖值（Glu），增加糖耐量，有效調(diào)節(jié)其血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度，降低其肝組織中 MDA的含量，提高GSH-Px、CAT、SOD 的活力，緩解“三多一少”癥狀，表明東風(fēng)菜總黃酮對四氧嘧啶糖尿病小鼠具有良好的降糖降脂及抗氧化作用。