吳靜，胡居吾，熊偉，顧震，王慧賓，Bae Young-soo,2，吳磊

（1.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）（2.韓國(guó)江原大學(xué)森林與環(huán)境學(xué)院森林生物質(zhì)材料工程，江原道春川市 200-701）

免疫調(diào)節(jié)，作為人體內(nèi)的一種重要防御，在宿主防御病原體和抗原的入侵起到了重要的作用[1]。來自血單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞可以通過識(shí)別感染性病原體啟動(dòng)先天免疫應(yīng)答，從而抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和微生物的入侵[2,3]。多糖，作為最基本的生物大分子是由單糖組成，廣泛分布在動(dòng)物、植物、藻類和真菌中。近年來，從天然資源中分離出的多糖已被證明具有廣泛的生物特性，如抗氧化、抗癌和免疫調(diào)節(jié)活性，已廣泛應(yīng)用于食品和制藥工業(yè)中[4～6]。很多植物多糖已被視為重要的免疫調(diào)節(jié)劑，由于其沒有明顯的毒副作用而且能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活化能力。一旦被激活，巨噬細(xì)胞可直接通過吞噬作用殺死病原體，并通過分泌一氧化氮、前列腺素 E2（PGE2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等炎癥介質(zhì)間接地殺死病原體[7]。多糖介導(dǎo)的免疫細(xì)胞的刺激可以通過結(jié)合巨噬細(xì)胞膜受體（PRRs）如樹狀細(xì)胞凝集素-1(Dectin-1)、Toll樣受體(TLRs)、補(bǔ)體受體 3（CR3），并引發(fā)了一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），以及轉(zhuǎn)錄因子如核因子（NF）-κB和激活蛋白（AP）-1[8]。

樟樹（Cinnamomum camphora（L.）Presl.）又名香樟、烏樟、樟木、芳樟等，是樟科（Lauraceae)樟屬（Cinnamomum）常綠高大闊葉喬木。樟樹是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹種和綠化樹種，在中國(guó)南部各省份廣泛分布，江西省將其命為“省樹”[9]。對(duì)該屬植物化學(xué)成分研究表明多含揮發(fā)油、多酚、黃酮、瑞諾烷類二萜、鞣質(zhì)、芳香性化合物、生物堿、木質(zhì)素、有機(jī)酸及多糖等成分[10～12]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，樟樹資源具有抑菌、消炎、止痛、抗癌、抗氧化及提高人體免疫力等藥用價(jià)值[13,14]。目前，素有中國(guó)最大的香精香料基地-“金溪縣”，對(duì)樟樹的開發(fā)利用中，很重要的一方面是對(duì)它的芳香資源的開發(fā)利用，而對(duì)于提取后的樟樹原料直接作為柴火進(jìn)行焚燒，對(duì)其果實(shí)多糖的研究更是處于空白。本研究以樟樹果實(shí)多糖為研究對(duì)象，在細(xì)胞和分子水平上探討其免疫調(diào)節(jié)的潛在作用機(jī)制。為合理開發(fā)利用樟樹資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹果實(shí)于2017年3月上旬由江西思派思香料化工有限公司提供，江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所天然產(chǎn)物研究室李雄輝研究員鑒定為樟樹(Cinnamomum camphora（L.）Presl.)的果實(shí)。

二甲基亞砜（DMSO）、脂多糖（LPS）、甲氮甲唑藍(lán)（MTT）均購(gòu)于Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、抗生素、胰蛋白酶、PBS（PH 7.4）和胎牛血清均購(gòu)于Gibco公司；RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；GAPDH、iNOS、TNF-α、COX-2引物購(gòu)于武漢博士德公司；ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及微量 BCA蛋白定量試劑盒北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；所需一抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司，二抗購(gòu)于美國(guó) Abcam公司；ELISA試劑盒購(gòu)于 R&D Systems；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）購(gòu)于 Bio-Rad；十二烷基硫酸鈉、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、對(duì)氨基苯磺酰胺、無水乙醇均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YC-1800實(shí)驗(yàn)室低溫噴霧干燥機(jī)，上海雅程儀器設(shè)備有限公司；H1850臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；TD6A-WS PPR超速冷凍離心機(jī)，金壇區(qū)華城潤(rùn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠；PCR擴(kuò)增儀，ABI公司；電泳槽，Bio-Rad公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī)，日本東京理化；Tecan infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Gel XP System伯樂凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；XD-202倒置生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)公司；Tanon5200數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；KQ-500B超聲波清洗儀，中國(guó)昆山超聲儀器有限公司；TGL-16GA CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo公司；Nanopure超純水系統(tǒng)，Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樟樹果實(shí)多糖的制備

將陰干的樟樹果實(shí)粉碎（3000.00 g），以 95%乙醇超聲提取3次，每次2 h，濾過，合并慮液，減壓回收乙醇，去除揮發(fā)性成分。將所得到的樟樹果實(shí)藥渣在室溫下陰干，去除乙醇?xì)埩?。以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1：50（m/V），100 ℃下熱回流提取兩次，每次提取2 h，離心取得上清液。將上清液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度125 ℃，出風(fēng)口溫85 ℃，壓強(qiáng)0.4 MPa得樟樹果實(shí)多糖粗粉。將所得樟樹果實(shí)粗多糖在熱水中復(fù)溶解，溶液用 Sevag試劑[氯仿：正丁醇=5：1（V/V）]5：1除蛋白 3次，上層液體經(jīng)減壓濃縮去除Sevag試劑殘留，加入4倍體積95%乙醇，攪拌并于4 ℃冰箱過夜，離心收集多糖沉淀。將多糖沉淀溶解于蒸餾水，透析袋透析48 h，經(jīng)冷凍干燥后得到樟樹果實(shí)多糖（CCFP），放入冰箱備用。多糖含量經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定為62.36%，提取得率為3.3%。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥液配制

RAW 264.7細(xì)胞從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）購(gòu)得，用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將CCFP溶解于DMSO中，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成供試液濃度，所配制的藥液中DMSO含量不能超過0.1%。

1.3.3 細(xì)胞活性檢測(cè)-MTT法

采用MTT法[15]檢測(cè)細(xì)胞存活率。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 RAW 264.7 細(xì)胞，按 1×106個(gè)/mL、100 μL/孔接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，吸取舊培養(yǎng)基，加入待測(cè)藥物的新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取舊培養(yǎng)基，于每孔中加入MTT工作液100 μL，繼續(xù)孵育3 h后每孔加入MTT終止液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h后，用酶標(biāo)儀在550 nm處測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率。相對(duì)細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組孔吸光值-空白組孔吸光值）/（對(duì)照組孔吸光值-空白組孔吸光值）×100%。

1.3.4 CCFP對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO、PEG2和TNF-α分泌的影響

將密度為1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，洗掉舊培養(yǎng)基，加入不同濃度供試藥物的新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以加入1 μg/mL LPS處理的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組。用Griess法[16]檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的分泌量，按ELISA檢測(cè)試劑盒操作方法測(cè)定TNF-α及PGE2的分泌量。

1.3.5 CCFP對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS、COX-2及TNF-αmRNA表達(dá)的影響

將5×106個(gè)細(xì)胞放入直徑為40 mm的小培養(yǎng)皿（4 mL的培養(yǎng)基）培養(yǎng)16 h，吸去舊培養(yǎng)基，加入含有100 μg/mL的CCFP分別處理10 min、60 min、180 min、360 min后收集細(xì)胞。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后擴(kuò)增 cDNA。引物序列和RT-RCR條件如表1所示。

表1 引物序列及RT-PCR條件Table 1 Primer sequences and conditions for RT-PCR

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶基因測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞形態(tài)生長(zhǎng)良好的 RAW264.7細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，用刮板輕輕刮下輕輕吹打至單個(gè)細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)法在顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5×105個(gè)細(xì)胞數(shù)目接種于小培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)基細(xì)胞用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒法向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NF-κB報(bào)告基因質(zhì)?；駻P-1報(bào)告基因質(zhì)粒。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去上清，再加入不同濃度梯度的CCFP處理細(xì)胞。熒光素酶活性采用試劑盒測(cè)定。

1.3.7 Western Blot檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞，接種5×106個(gè)細(xì)胞于直徑為60 mm的4 mL培養(yǎng)皿中，于上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 h。吸去舊的培養(yǎng)基，加入 100 μg/mL的CCFP分別處理不同的時(shí)間點(diǎn)后收集細(xì)胞。用RIPA裂解液法提取細(xì)胞蛋白，按 BCA試劑盒法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定核蛋白濃度。移取 30 μL體系核蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，采用半干半濕法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于搖床，將膜取出，放在搖床上，1*TBS 10 mL清洗一次，10 min后倒掉，用3% BSA 5 mL室溫洗膜1 h后倒掉。TTBS 10 mL洗三次，每次10 min，一抗2.5 μL與5 mL 3%BSA混合清洗1 h后回收一抗，TTBS 10 mL洗三次，每次10 min倒掉，對(duì)應(yīng)二抗Rabbit/mouse 2.5 μL+5 mL 3%BSA清洗1 h后倒掉。TTBS 10 mL洗三次，每次10 min后顯影。洗膜后加入辣根過氧化物酶試劑顯色，將混合液滴加到PVDF膜上，用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像。放入暗室預(yù)設(shè)曝光時(shí)間為30 s、60 s、90 s、120 s和5 min。檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平。

1.3.8 結(jié)果分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組之間的差異性采用單向方差分析通過統(tǒng)計(jì)軟件包 SPSS 19.0版，p＜0.05認(rèn)為有顯著性差異，p＞0.05則無顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 樟樹果實(shí)多糖對(duì)炎癥因子釋放的影響

圖1 CCFP對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及炎癥因子含量的影響Fig.1 The effects of CCFP on cells viability and the contents of cytokines secretion in RAW 264.7

為了研究樟樹果實(shí)多糖（CCFP）對(duì) RAW264.7細(xì)胞活性的影響，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)CCFP一定的濃度范圍內(nèi)細(xì)胞的存活率。結(jié)果如圖1（a）所示，在給藥范圍12.5～500 μg/mL內(nèi)，細(xì)胞存活率所呈現(xiàn)的趨勢(shì)與空白對(duì)照組相比基本一致，這說明CCFP在濃度12.5～500 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞并無毒性，可進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)研究。

細(xì)胞因子是細(xì)胞間的信號(hào)分子，由免疫和非免疫細(xì)胞分泌，在免疫反應(yīng)中起到重要的作用?；罨木奘杉?xì)胞能夠釋放大量的細(xì)胞因子，比如 NO，TNF-α和 PGE2。這些炎癥因子在細(xì)胞毒性/抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[17,18]。因此，我們將NO的釋放水平作為免疫刺激中巨噬細(xì)胞活化的指標(biāo)之一。NO的含量測(cè)定采用Griess試劑法，結(jié)果如圖1（b）所示，正常組中 RAW264.7細(xì)胞只釋放少量的 NO（3.12±0.12 μM），隨著給藥濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量逐漸增加，并呈現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系。在給藥濃度為100 μg/mL時(shí)，NO的分泌量達(dá)到最大（53.53±4.25 μM）。另一方面，在給藥濃度在12.5～50 μg/mL范圍時(shí)，RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量比LPS組低，說明CCFP比LPS更溫和[19]，適合作為免疫調(diào)節(jié)劑。

TNF-α和PGE2兩個(gè)細(xì)胞因子是免疫刺激中巨噬細(xì)胞活化的另外兩個(gè)指標(biāo)。為進(jìn)一步探討CCFP如何作用于巨噬細(xì)胞，通過 ELISA試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TNF-α和PGE2細(xì)胞因子的分泌，結(jié)果如圖1（c和d）所示，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，CCFP能夠促進(jìn)TNF-α和PGE2細(xì)胞因子的分泌，與NO分泌的結(jié)果一致都呈現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系。在給藥濃度為 100 μg/mL時(shí)，TNF-α和 PGE2的分泌量達(dá)到最大，分別為1008.32±35.23 pg/mL和434.56±25.23 pg/mL。為了排除CCFP污染而引起的炎癥因子釋放，我們向?qū)嶒?yàn)組中加入內(nèi)毒素B（PolyB），實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1（b-d）所示，內(nèi)毒素B（PolyB）能夠降低LPS激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，而對(duì)CCFP激活巨噬細(xì)胞的炎癥因子并無影響，這表明CCFP并沒有污染。

2.2 CCFP對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的影響

iNOS是重要的內(nèi)源性免疫介質(zhì)之一，在正常的免疫功能中起重要作用，包括巨噬細(xì)胞的活化和宿主對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體的防御[20]。以上研究結(jié)果表明，CCFP能激活巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，接下來我們想確定CCFP是否對(duì)巨噬細(xì)胞中COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達(dá)有促進(jìn)作用，用CCFP處理細(xì)胞10 min、30 min、60 min、180 min、360 min 后，COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達(dá)采用RT-PCR測(cè)定，如圖2所示。結(jié)果表明，CCFP能夠顯著誘導(dǎo)COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達(dá)并呈現(xiàn)一定的時(shí)效關(guān)系。與此同時(shí)，研究人員[21]發(fā)現(xiàn)多糖可以誘導(dǎo)RAW264.7產(chǎn)生NO、PGE2和TNF-α是通過上調(diào)iNOS、COX-2和TNF-αmRNA表達(dá)來完成的，這與2.1的研究結(jié)果基本一致。以上研究表明 CCFP通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中 COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞中NO、PGE2和TNF-α的分泌量，這與Wu[22]和Shen[23]等研究的猴頭菇和麩皮多糖免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制一致。

圖2 CCFP對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子iNOS、COX-2和TNF-α基因表達(dá)的影響Fig.2 The effect of CCFP on the expression of mRNAs of iNOS,COX-2, and TNF-α in RAW 264.7 cells

2.3 CCFP對(duì)TRL4介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響

NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子，廣泛控制著細(xì)胞內(nèi)一些基因的表達(dá)包括iNOS，TNF-α和 IL-6，以及參與細(xì)胞凋亡，細(xì)胞衰老，炎癥與免疫等反應(yīng)過程[24]。為進(jìn)一步研究NF-κB和AP-1是否與CCFP誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 COX-2、iNOS和 TNF-α基因的表達(dá)有關(guān)，在RAW264.7細(xì)胞中構(gòu)建NF-κB-Luc和AP-1-Luc，采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法考察CCFP對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NF-κB和AP-1的表達(dá)情況。結(jié)果（圖3a，b）：在沒有受到CCFP刺激的細(xì)胞，NF-κB和AP-1的表達(dá)量分別為1.00±0.12 和1.00±0.12，而經(jīng)12.5 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL 的 CCFP 處理RAW264.7細(xì)胞后，NF-κB和AP-1的表達(dá)量顯著增加，分別為：6.32±1.24 和 2.34±1.45，12.45±2.56 和8.60±2.56，14.67±2.86 和 11.32±3.22，18.75±3.56 和14.56±3.78。這充分說明CCFP對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用是通過NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子的參與。

當(dāng)受到多種細(xì)胞外刺激如LPS，促炎性細(xì)胞因子和多糖時(shí)，MAPKs蛋白激酶家族將會(huì)參與發(fā)起并激活NF-κF和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子活化[25]。最近研究報(bào)道，黃芪多糖、Sutherlandia frutescens多糖、靈芝多糖通過激活磷酸化MAPKs蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[26]。

圖3 CCFP對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（a）和AP-1（b）的影響Fig.3 Effect of CCFP on the nuclear translocation of NF-κB (a)and AP-1 (b)

因此，為了解CCFP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化期3條關(guān)于MAPK的信號(hào)通路的蛋白表達(dá)情況。免疫印跡法檢測(cè)了ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化水平，圖4（a-b）研究結(jié)果表明，CCFP（100 μg/mL）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞能夠迅速激活p-ERK MAPKs，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性關(guān)系。而JNK，p-JNK，p-38，p-p38，ERK的表達(dá)并無變化，說明 CCFP誘導(dǎo)細(xì)胞活化可能和激活p-ERK MAPK蛋白信號(hào)通路有關(guān)。這與之前的報(bào)道的黃芪多糖免疫調(diào)節(jié)活性通過激活p-ERK MAPK蛋白信號(hào)通路機(jī)制一致[27]。Toll樣受體（TLR）在識(shí)別病原體和激活先天免疫中起著重要的作用，TLR4是在細(xì)胞膜上最先發(fā)現(xiàn)的Toll蛋白，可以識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖（LPS）[28]，它在增強(qiáng)天然免疫應(yīng)答和多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生中起著重要作用。此外，相關(guān)研究證實(shí)天然多糖如黃精多糖[29]，菌菇多糖[30]，黃芪多糖[31]誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞主要是通過與TLR4受體結(jié)合，更重要的是，TLR4一旦被激活，它能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)從而激活相關(guān)蛋白，如 ERK、JNK和p38蛋白的激活，以及轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和AP-1的表達(dá)[32]。本研究通過免疫印跡法，對(duì)CCFP處理細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)（5，10，30，60 min），結(jié)果如圖4（c-d）所示，TLR4受體蛋白表達(dá)隨著反應(yīng)的進(jìn)行而逐漸增強(qiáng)，研究結(jié)果表明TLR4受體是CCFP激活細(xì)胞的膜結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)可以說明CCFP通過與細(xì)胞膜上TLR4受體結(jié)合，向下引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而激活巨噬細(xì)胞，釋放大量的炎癥因子。

圖4 CCFP對(duì)磷酸化ERK1/2，p-JNK，p38 MAPK(a)以及TLR4(b)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of CCFP on the phospho-ERK1/2, the phospho-JNK, the phospho-p38 MAPK (a-b) and TLR4 (c-d)

3 結(jié)論

3.1 巨噬細(xì)胞是一種吞噬細(xì)胞，在先天免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，在宿主遇到病原微生物入侵時(shí)，巨噬細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞（APC），將抗原遞呈給 T淋巴

細(xì)胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。此外，巨噬細(xì)胞在胚胎發(fā)生、腫瘤發(fā)生、皮膚創(chuàng)傷愈合和造血等方面也發(fā)揮著重要作用[33]。因此，巨噬細(xì)胞通常作為理想的細(xì)胞模型來評(píng)估活性物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)性能。

3.2 樟樹作為江西省省樹，在開發(fā)和利用上面還存在很多不足。尤其是以江西省金溪縣為主，雖然目前對(duì)樟樹中揮發(fā)性成分的提取和應(yīng)用有了一定的規(guī)模，但對(duì)于提取后的殘?jiān)]有物盡其用。本研究發(fā)現(xiàn)樟樹果實(shí)多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性首先通過與巨噬細(xì)胞 TRL4膜受體結(jié)合，誘導(dǎo)下游 p-ERK MAPKs蛋白的激活，NF-κB和 AP-1轉(zhuǎn)錄因子以及COX-2、iNOS和TNF-α基因的表達(dá)的上調(diào)，從而釋放相應(yīng)的NO，TNF-α和PGE2等炎癥因子。據(jù)文獻(xiàn)可知，本研究是首次以樟樹果實(shí)多糖為研究對(duì)象闡述其可能存在的免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制，為合理開發(fā)利用樟樹資源尤其是樟樹農(nóng)林廢棄物提供理論依據(jù)和參考。