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(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容外科，重慶 400038；2.重慶市畜牧科學(xué)研究院，重慶 400039)

放射性皮膚損傷是臨床上較為常見的一種難愈性創(chuàng)面，主要出現(xiàn)在放療和核事故患者中，具有難治性、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[1]。針對(duì)放射性損傷難愈合的機(jī)制現(xiàn)有很多研究觀點(diǎn)。曹衛(wèi)紅等[2]認(rèn)為放射導(dǎo)致皮膚難愈合的原因是照射后局部血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等凋亡增加；Goessler等[3]認(rèn)為相對(duì)于普通創(chuàng)面，放射性損傷會(huì)降低患處多種細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制放射性創(chuàng)面的正常愈合。因此，針對(duì)上述致傷機(jī)制，很多治療方案也應(yīng)運(yùn)而生，Kinoda等[4]使用含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的低分子肝素/魚精蛋白納米顆粒，有效促進(jìn)了大鼠輻照后皮膚創(chuàng)面的愈合；Yu等[5]提出殼聚糖納米顆粒加載血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可以促進(jìn)局部血管內(nèi)皮活化，促進(jìn)新血管重建，恢復(fù)患處血供以促進(jìn)放射性創(chuàng)面的愈合；黃紅梅等[6]則在臨床上應(yīng)用富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)治療難愈性皮膚潰瘍，并取得了一定的療效。雖然上述治療方案取得了一定的成果，但是仍存在許多問題，如創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，單一使用某種生長(zhǎng)因子并不能達(dá)到最好的促愈合效果； PRP內(nèi)雖然含有多種生長(zhǎng)因子，但單獨(dú)使用時(shí)，仍存在易流失，不能提供良好的微環(huán)境供細(xì)胞生長(zhǎng)等問題。因此如何保證PRP在修復(fù)過程中保持最大的利用率，維持相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境，更加有效地促進(jìn)組織的修復(fù)，仍是需要研究的課題。

我們課題組前期成功研發(fā)出了小腸黏膜下層(small intestine submucosa, SIS)仿生雙層敷料，并且證實(shí)SIS仿生雙層敷料可以顯著縮短普通傷口愈合時(shí)間[7]。SIS仿生雙層敷料上層是致密的SIS膜，可以有效抵御細(xì)菌入侵，下層疏松多孔的三維立體結(jié)構(gòu)，不僅可以為細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移提供良好的微環(huán)境，還可以吸附PRP，大大減少不必要的損耗，達(dá)到最大的利用價(jià)值[7]。因此，本研究使用SIS仿生雙層敷料作為PRP的載體，觀察SIS仿生雙層敷料復(fù)合PRP對(duì)大鼠難愈性皮膚創(chuàng)面愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 SIS的制備

根據(jù)Wang等[7]報(bào)道的方法制備豬SIS及SIS冷凍凝膠復(fù)合SIS膜雙層敷料，具體方法為：取新鮮豬小腸，去除漿膜層和肌層，通過脫脂、胰酶消化、去垢劑清洗等序貫步驟制備SIS單純膜。將SIS膜在低溫下打碎后，經(jīng)過胃蛋白酶酶解、鹽析離心、醋酸溶解、透析、凍干等步驟制備出SIS粉末。取SIS粉末溶于2-(N-嗎啡基)乙磺酸(Sigma)緩沖液中，4 ℃攪拌過夜。SIS溶解液、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Sigma)、N-羥基琥珀酰亞胺(Sigma)按照8 ∶ 1 ∶ 1混合后，轉(zhuǎn)移至底部鋪有SIS膜的培養(yǎng)皿中，-80 ℃冷凍交聯(lián)24 h。漂洗后使用凍干機(jī)于-80 ℃真空干燥，制備出SIS仿生雙層敷料，4 ℃冰箱保存。

1.2 PRP的制備

采用Landesberg二次離心法制備PRP[8]。將制得的PRP置于-80 ℃冰箱保存。使用前使用10%CaCl2激活。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，即對(duì)照組(Control組)、SIS修復(fù)組(SIS組)、PRP修復(fù)組(PRP組)、SIS復(fù)合PRP修復(fù)組(SIS+PRP組)。使用4 mL/kg 10%的水合氯醛行腹腔注射麻醉，剔除大鼠背毛，使用X射線照射儀對(duì)大鼠背部直徑3 cm的區(qū)域進(jìn)行總劑量25 Gy的輻照，大鼠的其他部位使用鉛板遮擋，于輻照區(qū)域用直尺和記號(hào)筆標(biāo)記1 cm×1 cm的擬去除范圍，碘伏棉球消毒3次后，75%酒精棉球脫碘，用眼科剪沿標(biāo)記范圍剪除皮膚及皮下全層，制成全層皮膚缺損的1 cm×1 cm創(chuàng)面。動(dòng)物模型制備完成后，各組分別進(jìn)行以下處理：SIS+PRP組創(chuàng)面予以滴加了0.2 mL PRP的SIS仿生雙層敷料覆蓋后外貼手術(shù)貼巾；SIS組創(chuàng)面予以滴加了0.2 mL PBS的SIS仿生雙層敷料覆蓋后外貼手術(shù)貼巾；PRP組創(chuàng)面予以滴加0.2 mL PRP后外貼手術(shù)貼巾；空白對(duì)照組創(chuàng)面予以滴加0.2 mL PBS后外貼手術(shù)貼巾。觀察各組大鼠術(shù)后第3、7、11、15天創(chuàng)面愈合情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。取術(shù)后15 d大鼠創(chuàng)面及周圍組織，進(jìn)行丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase,SOD)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, Elisa)

將小鼠皮膚組織樣本去除皮下脂肪，放入預(yù)冷的研缽內(nèi)邊研磨邊加液氮，至組織完全研磨成粉末，加入PBS制成勻漿，將組織勻漿以12 000 rpm離心10 min，取上清。按照Elisa試劑盒說明書(abcam)，使用化學(xué)比色法分別測(cè)定MDA含量及SOD活性。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot,WB)

每20 mg皮膚組織加入200 μL含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液(abcam)，勻漿至充分裂解。12 000 rpm離心5 min，取上清液，用BCA法(abcam)測(cè)定各組上清液蛋白濃度。于凝膠成像儀(bio-rad)中曝光獲取圖像，使用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量各條帶的灰度值，將對(duì)照組中目的條帶與GAPDH條帶的灰度值之比設(shè)置為1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率比較

通過觀察可見，隨著時(shí)間的推移，各組大鼠背部皮膚創(chuàng)面均逐漸縮小，以SIS+PRP組愈合效果最為顯著，在術(shù)后第3，7，11天愈合率均高于其他組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，術(shù)后15 d，創(chuàng)面已愈合(97.6±4.6)%，創(chuàng)面愈合順利，未出現(xiàn)紅腫、破潰情況。而SIS組與PRP組術(shù)后15 d創(chuàng)面愈合約90%，2組各個(gè)時(shí)間段愈合率未見明顯不同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是各個(gè)時(shí)間點(diǎn)愈合率均優(yōu)于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率比較(%)

2.2 各組大鼠皮膚氧化應(yīng)激水平比較

術(shù)后15 d，SIS+PRP組大鼠難愈性皮膚創(chuàng)面的MDA含量(5.58±0.86)μmol/g顯著低于對(duì)照組(13.71±2.04)μmol/g、SIS組(11.26±1.79)μmol/g、PRP組(10.18±1.73)μmol/g，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1a。術(shù)后15 d，SIS+PRP組大鼠難愈性皮膚創(chuàng)面的SOD含量(17.60±3.89)U/mL顯著高于對(duì)照組(5.02±2.05)U/mL、SIS組(7.10±2.41)U/mL、PRP組(11.37±2.96)U/mL，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1b。

a:MDA;b:SOD ns:P>0.05;*:P<0.05;#:P<0.01

2.3 各組大鼠皮膚Nrf2表達(dá)的比較

術(shù)后15 d，SIS+PRP組大鼠難愈性皮膚創(chuàng)面的Nrf2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(3.18±0.64)顯著高于對(duì)照組(1.00±0.00)、SIS組(1.17±0.22)、PRP組(1.56±0.39)，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。

a:WB圖片；b:蛋白定量分析 ns：P>0.05；*：P<0.05；#:P<0.01

2.4 SIS復(fù)合PRP促進(jìn)Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路的活化

術(shù)后15 d，SIS+PRP組大鼠難愈性皮膚創(chuàng)面p-AKT及p-GSK-3β的相對(duì)表達(dá)量(3.94±0.71、2.95±0.50)顯著高于對(duì)照組(1.00±0.00、1.00±0.00)、SIS組(1.86±0.35、1.46±0.19)、PRP組(2.77±0.52、1.91±0.29)，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖3a～c。而SIS+PRP組Fyn的相對(duì)表達(dá)量(0.31±0.19)顯著低于對(duì)照組(1.00±0.00)、SIS組(0.89±0.21)、PRP組(0.56±0.20)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見圖3a、d。

a:WB圖片；b:P-AKT蛋白定量分析；c:p-GSK蛋白定量分析；d：Fyn蛋白定量分析 ns：P>0.05；*：P<0.05；#:P<0.01

3 討論

放射治療作為一種標(biāo)準(zhǔn)的局部治療方式，是很多惡性腫瘤的輔助治療手段，但隨著應(yīng)用增加，照射部位的放射性皮膚損傷也越來越多，當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重放射性損傷時(shí)，會(huì)使基底細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等遭到嚴(yán)重破壞，引起局部血運(yùn)障礙，并影響炎癥細(xì)胞粘附及遷出血管，使局部生長(zhǎng)因子濃度低于普通創(chuàng)面。生長(zhǎng)因子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與功能等多種作用，因此補(bǔ)充外源性生長(zhǎng)因子，有利于難愈性創(chuàng)面的修復(fù)[1]。PRP是通過將自體新鮮全血進(jìn)行離心后取得富含血小板和血漿的濃縮物，因其激活后可以釋放血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)、VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors,FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)等多種生長(zhǎng)因子，所以被廣泛應(yīng)用于難愈性創(chuàng)面、骨骼肌肉、神經(jīng)等組織的修復(fù)[9-11]。但是，單純使用PRP存在易流失、浪費(fèi)成分、不能提供很好的三維立體空間供細(xì)胞生長(zhǎng)等問題。

我們課題組前期研發(fā)出了SIS仿生雙層敷料，該敷料不僅可以防止細(xì)菌入侵，還可以為傷口創(chuàng)造濕潤(rùn)環(huán)境，為細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移提供必要的空間結(jié)構(gòu)，并且在其緩慢降解過程中釋放多種生長(zhǎng)因子，經(jīng)研究證實(shí)該敷料可以有效促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合[7]。而另一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果顯示[12]，雖然SIS在降解過程中可以釋放生長(zhǎng)因子，但含量并不高，VEGF含量約為(93.8±3.033)×10-3ng/mL，bFGF含量約為(121.8±2.683)×10-3ng/mL，僅僅依靠SIS仿生雙層敷料自身釋放的生長(zhǎng)因子濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到放射性損傷創(chuàng)面愈合生長(zhǎng)因子濃度需求。

因此，本文將SIS仿生雙層敷料作為吸附PRP的載體，制備出SIS+PRP敷料，用來觀察其對(duì)放射性損傷創(chuàng)面愈合的影響，以期解決單用PRP易流失，單用SIS仿生雙層輔料生長(zhǎng)因子含量不足的問題。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，使用SIS+PRP治療方案在治療不同階段的皮膚創(chuàng)面愈合率均顯著優(yōu)于單用SIS或PRP的大鼠，這表明SIS+PRP治療方案確實(shí)可以有效促進(jìn)因放射所致的難愈性創(chuàng)面愈合。

為了探究SIS+PRP治療方案促進(jìn)放射性皮膚損傷創(chuàng)面愈合的機(jī)制，我們繼續(xù)研究了SIS+PRP治療方案對(duì)于大鼠皮膚氧化應(yīng)激水平、Nrf2蛋白表達(dá)情況和Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路活化情況的影響。我們通過研究發(fā)現(xiàn)，SIS+PRP治療方案能有效降低細(xì)胞MDA含量，提高SOD含量，這表明SIS+PRP治療方案可以降低創(chuàng)面氧化應(yīng)激水平。Rong等[13]已經(jīng)證明Nrf2蛋白對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制和保護(hù)作用，為了探究SIS+PRP治療方案降低創(chuàng)面氧化應(yīng)激水平與Nrf2蛋白的關(guān)系，我們檢測(cè)了不同治療方案處理后創(chuàng)面細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過SIS+PRP治療方案處理后的創(chuàng)面其細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)量顯著高于單用SIS或PRP以及對(duì)照組的創(chuàng)面。這表明SIS+PRP治療方案可以通過提高Nrf2蛋白表達(dá)量，降低創(chuàng)面細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。我們知道細(xì)胞Nrf2表達(dá)主要是通過Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路調(diào)控，研究證明，通過磷酸化Akt可以進(jìn)一步磷酸化p-GSK-3β，使其失去活性，從而降低Fyn的表達(dá)，減少Nrf2的出核和泛素化[14-15]。為了研究SIS+PRP治療方案對(duì)于Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路的影響，我們檢測(cè)了術(shù)后15 d大鼠皮膚創(chuàng)面p-AKT及p-GSK-3β的相對(duì)表達(dá)量及Fyn的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)SIS+PRP治療方案可以有效提高p-AKT及p-GSK-3β的相對(duì)表達(dá)，降低Fyn表達(dá)。這說明SIS+PRP治療方案可能是通過影響Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路活化，增加Nrf2蛋白量，來降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

綜合以上研究，我們認(rèn)為SIS仿生雙層敷料構(gòu)建了類似于人體表皮和真皮的雙層結(jié)構(gòu)，減少了外部環(huán)境對(duì)創(chuàng)面的干擾，為創(chuàng)面愈合提供了適宜的濕潤(rùn)環(huán)境，也提供了適宜細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的三維空間，另外PRP釋放大量的生長(zhǎng)因子補(bǔ)充了放射性創(chuàng)面對(duì)生長(zhǎng)因子的需求，因此使創(chuàng)面愈合顯著優(yōu)于其他組，而促進(jìn)愈合的機(jī)制可能是通過活化Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平達(dá)到的。

雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIS+PRP組可以促進(jìn)放射性損傷創(chuàng)面的愈合，但仍有許多科學(xué)問題尚未解決：①本研究?jī)H從氧化應(yīng)激及其信號(hào)通路的角度探討了SIS+PRP的治療效果，是否有細(xì)胞凋亡保護(hù)等其他機(jī)制參與；②不同方式制備出的PRP濃度和生長(zhǎng)因子的含量并不相同，不同濃度的PRP在促進(jìn)放射性損傷創(chuàng)面愈合的效果是否一樣，放射性損傷創(chuàng)面所需各種生長(zhǎng)因子的最佳濃度是多少；③在大鼠模型上證實(shí)SIS+PRP治療方案對(duì)于放射性皮膚損傷導(dǎo)致的難愈性創(chuàng)面具有較好的療效，但是其對(duì)于患者的治療作用如何尚不清楚。

綜上所述，小腸黏膜下層復(fù)合富血小板血漿可以促進(jìn)難愈性皮膚潰瘍的修復(fù)，可能與Akt/GSK-3β/Fyn信號(hào)通路介導(dǎo)的Nrf2/ARE活化有關(guān)。