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(福州總醫(yī)院腫瘤放射治療中心，福建 福州 350025)

黑色素瘤通常起源于上皮基底層黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，其惡性程度較高，極易發(fā)生淋巴或血液轉(zhuǎn)移，因此預(yù)后通常較差，是危害性較為嚴(yán)重的惡性腫瘤之一[1-4]。人體表皮生長因子4(Human epidermal growth factor 4, HER4)是一種跨膜受體蛋白，在與配體結(jié)合后通過自身磷酸化參與細(xì)胞的信號傳遞，信號在細(xì)胞內(nèi)通過激酶級聯(lián)傳遞以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及分裂。有多項(xiàng)研究證實(shí)，在腫瘤組織中HER4存在過度表達(dá)，并且與多種腫瘤疾病的預(yù)后有著較為密切關(guān)聯(lián)[5-8]。群集分化44(cluster of differentiation 44，CD44)屬于糖基化的細(xì)胞表面黏附分子家族，作為一種跨膜受體蛋白廣泛表達(dá)與上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。近年來有多項(xiàng)研究相繼確認(rèn)CD44可作為多種惡性腫瘤的干細(xì)胞標(biāo)志物[9-11]。本次研究目的在于探討黑色素瘤組織中HER4、CD44的表達(dá)情況及其與黑色素瘤患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料對2006年1月至2017年12月于本院經(jīng)病理確診并收治的共93例黑色素瘤患者采集腫瘤組織標(biāo)本，在這些患者中有59例男性以及34名女性。年齡范圍在30歲～84歲之間，中位年齡56歲。所有病人依據(jù)AJCC8版TNM分期[12]，其中I期23例、II期32例、III期28例及IV期10例。在2006～2017年的持續(xù)隨訪過程中共死亡84例，存活9例。

1.2研究方法

1.2.1 免疫組化染色 采用3um厚石蠟切片按照使用說明書進(jìn)行染色。首先應(yīng)用熱誘導(dǎo)抗原表位修復(fù)法修復(fù)抗原，采用10mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6)蒸汽熏蒸玻片30分鐘。隨后加入1∶400稀釋并在4℃的溫度條件下孵育過夜的抗CD44抗體及1:300稀釋并在4℃的溫度條件下孵育過夜的抗HER4抗體。然后加入37℃孵育的EnVision第二抗體并用3-3′二氨基聯(lián)苯胺顯色，隨后應(yīng)用蘇木紫及伊紅復(fù)染。

染色切片的讀片工作由兩名具有10年以上病理科工作經(jīng)驗(yàn)的執(zhí)業(yè)醫(yī)師對比未使用原抗體的陰性對照進(jìn)行，并獨(dú)立評估陽性腫瘤細(xì)胞的相對數(shù)量(范圍:0～100%)和染色強(qiáng)度(范圍:0～3分: 0分=無染色，1分=弱染色，2分=中度染色，3分=強(qiáng)染色)。本次試驗(yàn)所用抗CD44抗體由賽默飛公司生產(chǎn)(克隆號：PC100)；抗HER4抗體由Gene公司生產(chǎn)(克隆號：EP2880Y)；EnVision第二抗體由Dako公司生產(chǎn)。

1.2.2 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗(yàn)分析分類資料組間差異，定量資料則根據(jù)數(shù)據(jù)分布特征采用參數(shù)或非參的方法分析組間差異。用簡單kappa系數(shù)描述HER4及CD44表達(dá)的相關(guān)性。進(jìn)一步采用Log-Rank檢驗(yàn)比較不同亞組患者生存時間的差異并繪制K-M生存曲線。應(yīng)用COX模型探索CD44及HER4表達(dá)對患者預(yù)后的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取值為0.05,當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1性別、年齡與HER4及CD44表達(dá)關(guān)系93人黑色素瘤組織中HER4表達(dá)陽性人數(shù)為73人，比例為78.49%；CD44表達(dá)陽性人數(shù)為65人，比例為68.89%。從圖1中可以看出HER4染色主要在細(xì)胞質(zhì)而CD44染色主要在細(xì)胞膜。從表1中可以看出，HER4及CD44的表達(dá)在不同性別、不同年齡及不同TNM分期等基線特征間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可見HER4及CD44的表達(dá)與年齡、性別及TNM分期間不存在相關(guān)性。

圖1 HER4及CD44在黑色素瘤組織中的表達(dá)情況(400×)A：未經(jīng)PE染色；B：PE染色；C：HER4表達(dá)集中在細(xì)胞質(zhì)；D：CD44表達(dá)集中在細(xì)胞膜

nHER4陽性陰性χ2 PCD44陽性陰性χ2P總數(shù)9373(78.49)20(21.51)65(68.89)28(31.11)性別 男5948(81.36)11(18.64)0.78270.376344(74.58)15(25.42)1.68250.1946 女3425(73.53)9(26.47)21(61.76)13(38.24)年齡 ≤605542(76.36)13(23.64)0.36210.547338(69.09)17(30.91)0.04110.8393 >603831(81.58)7(18.42)27(71.05)11(28.95)分期 I期2319(82.61)14(17.39)2.03560.153616(84.21)7(15.79)0.08590.7695 II期3226(81.25)6(18.75)24(75.00)8(25.00) III期2821(75.00)7(25.00)19(67.86)9(32.14) IV期107(70.00)3(30.00)6(60.00)4(40.00)

2.2 HER4表達(dá)與CD44表達(dá)間的關(guān)系從表2中可以看出，93個患者中同時存在HER4表達(dá)陽性及CD44表達(dá)陽性的研究對象共有58人占全部研究對象的62.37%；有HER4表達(dá)而沒有CD44表達(dá)的研究對象共有7人，占全部研究對象的7.53%；有CD44表達(dá)而沒有HER4表達(dá)的研究對象共有15人，共占全部研究對象的16.13%；既無HER4表達(dá)也無CD44表達(dá)的研究對象共13人，占全部研究對象的13.98%。McNemar檢驗(yàn)結(jié)果顯示CD44表達(dá)與HER4有較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系(簡單Kappa系數(shù)=0.4094,P<0.05)。

表2 HER4表達(dá)與CD44表達(dá)關(guān)系(例，%)

2.3 HER4表達(dá)及CD44表達(dá)對患者生存時間的影響HER4表達(dá)陽性患者中位生存時間為15.65個月，其三年存活率為9.78%；HER4表達(dá)陰性患者中位生存時間為46.62個月，其三年存活率為58.06%；Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果提示HER4表達(dá)陽性患者與HER4表達(dá)陰性患者生存時間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CD44表達(dá)陽性患者中位生存時間為21.63個月，其三年存活率為29.03%；CD44表達(dá)陰性患者中位生存時間為24.37個月，其三年存活率為33.33%；Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果提示CD44表達(dá)陽性患者與CD44表達(dá)陰性患者生存時間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同HER4及CD44表達(dá)情況患者生存曲線如圖2所示。

圖2 不同HER4及CD44表達(dá)情況患者K-M生存曲線A為CD44表達(dá)陽性患者及CD44表達(dá)陰性患者的K-M生存曲線，Log-Rank檢驗(yàn)提示兩組患者生存時間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.5147)；B為HER4表達(dá)陽性患者及HER4表達(dá)陰性患者的K-M生存曲線，Log-Rank檢驗(yàn)提示兩組患者生存時間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)

應(yīng)用COX模型對不同HER4及CD44表達(dá)情況患者進(jìn)行影響因素分析，結(jié)果如表3所示，可以看出HER4陽性表達(dá)是影響患者愈后的危險因素，其風(fēng)險比為4.12(P<0.01)。CD44陽性表達(dá)的風(fēng)險比為1.63(P=0.1041)，雖然統(tǒng)計學(xué)角度無法確定其為患者預(yù)后的危險因素，但結(jié)合K-M曲線不難看出CD44陽性表達(dá)對患者預(yù)后有一定提示作用。

表3 HER4表達(dá)及CD44表達(dá)對患者生存時間的影響

3 討 論

正常情況下HER4的表達(dá)多見于骨骼肌、平滑肌細(xì)胞、腦組織、肺、胃黏膜等組織中，并且呈低水平或陰性表達(dá)。而在惡性腫瘤中HER4表達(dá)明顯高于正常組織及良性腫瘤組織[13]。HER4的過度表達(dá)可能與細(xì)胞的凋亡、浸潤及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5, 14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，93例患者中HER4的表達(dá)陽性率高達(dá)78.49%。在排除了性別、年齡與HER4表達(dá)可能存在的相關(guān)性的情況下，HER4表達(dá)可能與黑色素瘤的發(fā)生有密切的關(guān)聯(lián)。有研究認(rèn)為在一些腫瘤中HER4存在過度表達(dá)并且對腫瘤進(jìn)展有促進(jìn)的作用，進(jìn)而縮短患者的生存期[15]，本研究得到了相似的結(jié)論，HER4在黑色素瘤組織表達(dá)增高，并主要分布在細(xì)胞質(zhì)。

CD44是一種單鏈跨膜糖蛋白，作為細(xì)胞表面黏著分子廣泛分布于細(xì)胞膜。介導(dǎo)多種生理及病理進(jìn)程，特別是惡性腫瘤細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移，常與CD44分子密切相關(guān)[9]。有研究提示CD44可以作為癌癥病人的預(yù)后因子來評價患者預(yù)后。本次研究將CD44的表達(dá)作為疾病預(yù)后的指標(biāo)并未發(fā)現(xiàn)其有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，該結(jié)果是否與樣本量有關(guān)還需進(jìn)一步研究。但HER4高表達(dá)的惡性黑色素瘤患者的生存率下降。

綜上所述，HER4過度表達(dá)在黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用并且與患者預(yù)后有密切的關(guān)系。這提示可以通過干預(yù)減少HER4的過度表達(dá)可能成為延緩或控制黑色素瘤病程發(fā)展的可行方法。