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(無錫市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 無錫 214000)

香煙煙霧(Cigarette smoke ，CS)是導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的主要危險(xiǎn)因素，目前尚無有效的治療方法來抑制這種疾病的進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)CS中含有大量自由基，這些自由基進(jìn)入人體后會引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]。也有研究[2]表明吸煙能夠引起肺纖維化，在肺纖維化進(jìn)程中肺泡上皮細(xì)胞的損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡情況均出現(xiàn)增加[3]。肺泡II型上皮細(xì)胞細(xì)胞(Alveolar type II epithelial cell cells，ATII)既可分化為I型也可通過優(yōu)勢分裂產(chǎn)生子代II型，當(dāng)ATII凋亡嚴(yán)重時(shí)，會影響肺損傷修復(fù)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1， TGF-1β)是啟動肺成纖維細(xì)胞激活的關(guān)鍵因素，調(diào)節(jié)其增殖、遷移、轉(zhuǎn)分化，TGF-β1激活的跨膜受體信號細(xì)胞核主要通過Smad家族的轉(zhuǎn)錄因子[4]。已有報(bào)道[5]證明在特發(fā)性纖維化中，TGF-1β會引起肺泡上皮細(xì)胞的凋亡，并且有研究[6]發(fā)現(xiàn)在smad2沉默模型中，阻斷了TGF-1β對上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。故本研究通過對ATII細(xì)胞進(jìn)行煙草提取物(Cigarette smoke Extra，CSE)處理，觀察煙草對其影響，并推測該過程受TGF-1β/smad2信號通路調(diào)節(jié)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1動物選擇6～7周齡的SD大鼠(購自成都達(dá)碩生物技術(shù)有限公司，scxk(川)2016-030)。

1.2主要試劑使用Dispase(BD Biosciences，Bedford，MA，USA)，PBS和低熔點(diǎn)(LMP)瓊脂糖(International Biotechnologies Inc.，New Haven，CT，USA)進(jìn)行ATII細(xì)胞分離；CD45 MicroBeads(Miltenyi Biotec Inc.， Auburn，CA，USA)，生物素化的抗大鼠上皮細(xì)胞粘附分子(Ep-CAM; e-Bioscience，San Diego，CA，USA)，用于選擇ATII。鏈霉親和素MicroBeads，抗生物素-PEG和FITC綴合的CD45抗體購自Miltenyi Biotec Inc.(Auburn，CA，USA). DNase I購買自 Sigma(St.Louis，MO，USA)；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz)；兔抗鼠smad2多克隆抗體(Santa Cruz)；兔抗鼠GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz)；兔抗鼠磷酸化smad2單克隆抗體(Cell signaling technology)；云煙(云南紅塔集團(tuán))。

1.3主要儀器流式細(xì)胞儀(德國Beckman Coulter公司)，紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer)，Western blot全能轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(bio-rad)，低溫高速離心機(jī)(Hermel)，倒置顯微鏡(蔡司)。

1.4方法

1.4.1 ATII細(xì)胞原代培養(yǎng)[7]取右下肺部組織，放入含有1mL分散酶的離心管內(nèi)37℃孵育6min。將分散液放入GentleMACS C管中，加入5 mL DMEM，100 U/mL青霉素G，100 μg/mL鏈霉素，10 μg/mL慶大霉素，2 mM/L谷氨酰胺，2.5μg·/mL兩性霉素B，20mM HEPES(pH7.4)和120 U/mL DNA酶I勻漿。離心10 min，棄去上清液。將ATII細(xì)胞在含有5%RS及20mMHEPES的DMEM中接種1天，在含有20%EHS的DMEM中培養(yǎng)4天，并加入 1%CS剝離的FBS以及10ng /mL KGF。

1.4.2 提取CSE 取一支去濾嘴的云煙，將其插在進(jìn)氣口上，點(diǎn)燃后使用抽氣裝置在排氣口勻速抽氣，使煙霧均勻通過10 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，每支香煙燃燒15 min，共燃燒10支，調(diào)節(jié)pH值至7.4，使用0.22 μm的濾菌網(wǎng)除去雜質(zhì)及細(xì)菌，測定320 nm處OD值為1.36±0.12，即為100%CSE，使用時(shí)將其稀釋至4%濃度待用[8]。

1.4.3 CSE處理細(xì)胞 將4%CSE溶液用達(dá)鼠ATII細(xì)胞培養(yǎng)24 h。

1.4.4 TUNEL assay 將ATII細(xì)胞固定在含有4%多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA，USA)的PBS中，并用0.2%triton X-100(Sigma Chemicals Inc。)透化，然后在潮濕室中37℃孵育1h。用Superblock Blocking Buffer(Pierce，Rockford，IL，USA)和3%正常驢血清的1:1混合物封閉細(xì)胞，并與抗proSP-C(Abcam，Cambridge，MA，USA，Ab-3786 )1h。將抗兔二抗Alexa-Fluor 594(Invitrogen Corp.，Carlsband，CA，USA)加入載玻片中并孵育30min。用含有DAPI(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)的Vectashield培養(yǎng)基裝載細(xì)胞，并通過熒光顯微鏡(Zeiss Axioskop 2，Thornwood，NY，USA)進(jìn)行分析。每10個高倍視野計(jì)算熒光素(熒光素-dUTP標(biāo)記的DNA)標(biāo)記的TUNEL陽性細(xì)胞凋亡ATII細(xì)胞的百分比(10～40倍)。

1.4.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 從組織中提取蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce; Thermo Fisher Scientific，Inc)測定蛋白質(zhì)濃度，將等量的蛋白質(zhì)(20 μg/泳道)進(jìn)行10～12%SDS-PAGE膠電泳分離目標(biāo)蛋白，將分離好的蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上(EMD Millipore，Billerica，MA，USA)。然后用5%的脫脂牛奶封閉膜2 h，用PBS洗滌，并在4 ℃下與以下一抗一起孵育過夜：TGF-β1抗體(目錄號：sc-130348，1∶1000稀釋)，抗smad2抗體(目錄號：sc-393312，1∶1000稀釋)和抗p- smad2抗體(目錄號8828s，1∶1000稀釋)。使用抗GAPDH抗體(目錄號：sc-32233; 1∶2000稀釋)作為內(nèi)參對照。隨后，將膜與山羊抗兔辣根過氧化物酶綴合的二抗(cat.no.ab6721; 1∶2000稀釋; Abcam)在室溫下孵育2h，并通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Pierce; Thermo Fisher Scientific，Inc.)檢測目的蛋白表達(dá)情況。蛋白質(zhì)印跡分析重復(fù)至少三次。

1.4.6 RT-PCR檢測目的因子mRNA表達(dá)水平 使用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen，Germantown，MD，USA)從ATII細(xì)胞中分離總RNA。測定TGF-β1、smad2探針購自Life Technologies。在逆轉(zhuǎn)錄之前，使用Nanodrop 1000分光光度計(jì)評估分離的RNA的量和質(zhì)量，0.5 mg RNA以使用qScript cDNA Supermix(Quanta Biosciences，Gaithersburg，MD，USA)合成cDNA，總樣品體積為30mL。RT-PCR的循環(huán)條件如下：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。使用C1000 Thermocycler(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，將基因表達(dá)水平計(jì)算為目標(biāo)因子與參考基因GAPDH(Life Technologies)的表達(dá)比值。使用ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本文數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩差異用student’st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TUNEL assay檢測細(xì)胞凋亡情況通過TUNEL assay檢測發(fā)現(xiàn)，相同放大視野(100×)中，對照組細(xì)胞生長良好，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞密度大，其相對凋亡量為(5.96±3.74)%；4%煙草提取物處理組的大鼠ATII結(jié)構(gòu)模糊，數(shù)量減少，并在其中觀察到了明顯的凋亡小體，其凋亡量(17.43±7.42)%與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 細(xì)胞凋亡情況a: 凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比較; b:熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況(100×)A：Control group；B：4% CSE processing group，白色箭頭所指為凋亡小體。與4% CSE processing group 比較，*P<0.05

2.2 Real-timePCR檢測TGF-1βmRNA表達(dá)情況通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，TGF-1βmRNA的表達(dá)量在4%煙草提取物處理組中其表達(dá)量明顯增多(0.11±0.049vs0.15±0.031)(見圖2)(P<0.05)；而Smad2的mRNA表達(dá)量各組未見顯著改變(0.12±0.049vs0.11±0.036)(P>0.05)，詳見圖3。

圖2 不同處理組TGF-1β表達(dá)量與4% CSE processing group 比較，*P<0.05

圖3 不同處理組smad2表達(dá)量

2.3 Western blot檢測TGF-1β及Smad2蛋白表達(dá)情況通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-1β蛋白的表達(dá)量在不同處理組顯示出了不同，其中4%煙草提取物處理組中其蛋白表達(dá)量明顯增多，且與照組相比具有顯著差異(圖4)(P<0.05)；Smad2的總蛋白表達(dá)量在各組未見顯著改變，但其磷酸化形式出現(xiàn)了顯著的變化，其中4%煙草提取物處理組中蛋白表達(dá)量明顯增多，且與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)，詳見圖5。

圖4 TGF1-β蛋白相對表達(dá)量A：Control group；B：4% CSE processing group。

圖5 p-amsd2 蛋白相對表達(dá)量A：Control group；B：4% CSE processing group；與4% CSE processing group 比較，*P<0.05

3 討 論

凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過程，在正常情況下，機(jī)體細(xì)胞凋亡與增殖維持著動態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)外的理化因素會引起細(xì)胞的過度凋亡，從而打破機(jī)體平衡導(dǎo)致組織、器官功能障礙[9]。國內(nèi)外的研究[10]表明，長期吸煙會引起肺組織細(xì)胞的凋亡，并且，長期吸煙的COPD患者肺組織細(xì)胞有大量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL assay發(fā)現(xiàn)了煙草提取物的確能增加ATII的凋亡。

TGF-β是一種多功能蛋白，最近的研究[11]表明，TGF-β1參與了細(xì)胞的凋亡過程，其活化能夠影響細(xì)胞的生長、分化等功能。Smad家族蛋白是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，當(dāng)TGF-β被激活后，可使胞漿內(nèi)的smads活化轉(zhuǎn)位入核，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)[12]，smad2的活性抑制后，可逆轉(zhuǎn)非甾體類抗炎藥誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，即起到抗凋亡的作用。同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道[13]，前列腺上皮細(xì)胞的凋亡中，TGF-β1/smad2信號通路起到了重要作用。由此可見，TGF-β1/smad2信號通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程起到了重要作用。本研究通過測定TGF-β1、smad2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該信號通路在CSE影響的ATII細(xì)胞凋亡中出現(xiàn)了明顯的改變，明確了該通路在誘導(dǎo)凋亡中的作用。

煙草提取物引起的氧化應(yīng)激在許多肺部疾病的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用，其毒性作用主要?dú)w因于凋亡和壞死[14]。研究發(fā)現(xiàn)ATI樣細(xì)胞對CSE的敏感性比ATII細(xì)胞更高[15]。細(xì)胞應(yīng)對CSE產(chǎn)生的活性氧(active oxygen species，ROS)有兩種方式。第一個通過激活紅系衍生的核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(Nuclear factor(erythroid-derived2)-like protein，Nrf2)提供抗氧化清除系統(tǒng)能力[16]。第二，細(xì)胞在不可修復(fù)的DNA損傷的情況下，通過smad2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對ROS誘導(dǎo)的DNA損傷作出響應(yīng)。本研究將ATII細(xì)胞暴露于4% CSE中，發(fā)現(xiàn) TGF-β1激活誘導(dǎo)暴露于CSE的ATII細(xì)胞凋亡。由于條件限制，本實(shí)驗(yàn)未從整體研究CSE對肺組織的影響及機(jī)制，也未進(jìn)一步明確TGF-β1/smad2信號通路在CSE損傷的作用。但本研究是將為是下一步研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

綜上所述，CSE中的有害物質(zhì)可能通過誘導(dǎo)ATII細(xì)胞凋亡引發(fā)肺組織損傷及功能障礙。其機(jī)制可能是CSE通過誘導(dǎo)TGF-β1/smad2信號通路激活，進(jìn)而引起凋亡的發(fā)生。本研究通過研究TGF-β1/smad2在誘導(dǎo)ATII凋亡的作用，可為臨床防治吸煙引起的肺損傷提供治療依據(jù)。